高書(shū)鋒，孔利華，雷 平，曾發(fā)姣，王升平，龔 平，周小玲，劉惠知

(湖南省微生物研究院，長(zhǎng)沙 410009)

β-D-葡萄糖醛酸苷酶(β-D-glucuronidase，GUSB)，是一種糖苷類(lèi)水解酶，多屬于糖基水解酶家族2和79，能催化各類(lèi)含β-D-糖苷鍵的化合物水解。當(dāng)前優(yōu)化微生物菌株產(chǎn)該酶文獻(xiàn)報(bào)道較少，Chouiter等[1]對(duì)樹(shù)舌靈芝產(chǎn)β-D-葡萄糖醛酸苷酶培養(yǎng)基和補(bǔ)料方式進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)酵14 d酶活提高5倍，達(dá)1.09 U/mL；張斌等[2]對(duì)畢赤酵母高效表達(dá)重組β-D-葡萄糖醛酸苷酶誘導(dǎo)方法進(jìn)行了研究，發(fā)酵5 d高效表達(dá)GAMG的酶活達(dá)1 970 U/mL；郭曉曉等[3]對(duì)產(chǎn)紫青霉β-D-葡萄糖醛酸苷酶的誘導(dǎo)表達(dá)進(jìn)行了研究，初始葡萄糖耗盡時(shí)，繼續(xù)誘導(dǎo)3 d和發(fā)酵2 d，酶活達(dá)2 356 U/mL，提高近3倍；吳文婷[4]對(duì)ChaetomiumglobosumS108菌株產(chǎn)β-D-葡萄糖醛酸苷酶工藝進(jìn)行了研究，發(fā)酵4 d酶活達(dá)900 U/mL；Ku等[5]對(duì)德氏乳桿菌Rh2產(chǎn)β-D-葡萄糖醛酸苷酶的66種培養(yǎng)基優(yōu)化篩選，厭氧發(fā)酵18 h，相對(duì)酶活提高8倍。上述優(yōu)化微生物菌株產(chǎn)該酶文獻(xiàn)報(bào)道所用菌種多屬真菌，代謝產(chǎn)酶周期較長(zhǎng)，為4 d至14 d，而德氏乳桿菌Rh2雖為細(xì)菌菌株，但產(chǎn)酶發(fā)酵方式為厭氧發(fā)酵，實(shí)際生產(chǎn)有一定困難。當(dāng)前有關(guān)好氧細(xì)菌產(chǎn)該酶的發(fā)酵工藝優(yōu)化研究尚未見(jiàn)報(bào)道，加之細(xì)菌具有代謝產(chǎn)酶周期短的優(yōu)勢(shì)，因此，有必要針對(duì)本實(shí)驗(yàn)室前期試驗(yàn)從健康雞腸道選育的產(chǎn)β-D-葡萄糖醛酸苷酶的飼用枯草芽孢桿菌JY24菌株，開(kāi)展產(chǎn)酶發(fā)酵工藝優(yōu)化，為后續(xù)工作中提升黃芩苷轉(zhuǎn)化率和轉(zhuǎn)化效率提供借鑒和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)JY24菌株，湖南省微生物研究院動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與疫病防控室分離選育保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基；基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：淀粉8 g、蛋白胨10 g、磷酸二氫鉀1 g、七水硫酸鎂0.5 g、氯化鈉5 g、黃芩苷誘導(dǎo)物1 g、蒸餾水1 L，pH 7.0～7.2。

1.1.3 主要試劑和儀器

標(biāo)準(zhǔn)品：對(duì)硝基酚-β-D-葡萄糖醛酸苷，Sigma Aldrich(>99%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))；對(duì)硝基苯酚，Dr.Ehrenstorfer GmbH(99.4%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))。TGL20M-II冷凍離心機(jī)、Tu-1810分光光度計(jì)、ZQZY-AS9振蕩培養(yǎng)箱、LRH400A生化培養(yǎng)箱和Agilent1260高效液相色譜儀。

1.2 方法

1.2.1 β-D-葡萄糖醛酸苷酶酶活檢測(cè)

(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。稱(chēng)取0.347 8 g對(duì)硝基酚，PBS定容至100 mL，搖勻，吸取4 mL，PBS定容至100 mL，即儲(chǔ)備液。稀釋儲(chǔ)備液為10～100 μmol/L系列標(biāo)準(zhǔn)液，檢測(cè)OD405，選擇合適梯度繪標(biāo)準(zhǔn)曲線。(2)酶活檢測(cè)。參照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行。酶活力單位：在pH 7.0、35 ℃條件下，每小時(shí)釋放1 μmol對(duì)硝基苯酚所需酶量為1個(gè)活力單位，記為U。酶活單位(U/mL)=對(duì)硝基酚釋放量(μmol)/保溫時(shí)間(h)/被檢液量(mL)。

1.2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

發(fā)酵時(shí)間設(shè)9個(gè)處理：6、12、18、24、30、36、42、48和54 h；轉(zhuǎn)速設(shè)4個(gè)處理：150、180、210和240 r/min；裝液量設(shè)5個(gè)處理：10%、15%、20%、25%和30%；初始pH值設(shè)5個(gè)處理：6.0、6.5、7.0、7.5和8.0；溫度設(shè)6個(gè)處理：29 ℃、31 ℃、33 ℃、35 ℃、37 ℃和39 ℃；接種量設(shè)5個(gè)處理：1%、2%、3%、4%和5%；上述不同處理均設(shè)3次重復(fù)。初始條件：采用三角瓶(500 mL)搖瓶發(fā)酵，接種量3%、初始pH 7.0、裝液量20%、溫度35 ℃、轉(zhuǎn)速220 r/min。分別測(cè)定不同發(fā)酵條件下各處理3次重復(fù)發(fā)酵液的酶活性，優(yōu)化發(fā)酵條件。

1.2.3 培養(yǎng)基成分優(yōu)化

碳源、氮源和磷源種類(lèi)篩選：計(jì)算基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基碳源、氮源和磷源中碳、氮和磷含量，分別用6種碳源(葡萄糖、蔗糖、淀粉、紅糖、糖蜜和麥麩)、7種氮源(蛋白胨、酵母粉、酵母膏、黃豆粉、牛肉膏、硝酸鉀和硫酸銨)和3種磷源(磷酸二氫鉀、1/2磷酸二氫鉀+ 1/2磷酸氫二鉀、磷酸氫二鉀)替換，優(yōu)化碳、氮和磷源種類(lèi)。無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)篩選：去除基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基所有無(wú)機(jī)鹽，分別添加8種0.002 mol/L的無(wú)機(jī)鹽(硝酸鉀、氯化鈉、氯化鈣、七水硫酸鎂、一水硫酸錳、三氯化鐵、七水硫酸亞鐵和五水硫酸銅)，CK不添加，優(yōu)化無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)。表面活性劑、生長(zhǎng)因子種類(lèi)和誘導(dǎo)物濃度篩選：表面活性劑設(shè)5個(gè)處理：PEG-400、Tween-20、Tween-80、TritonX-100和SDS，SDS添加濃度為1.0 g/L，其他添加濃度為1.0 mL/L，CK不添加；生長(zhǎng)因子設(shè)3個(gè)處理：玉米漿、糖蜜和麥芽汁，添加濃度為2.0 mL/L，CK不添加；黃芩苷誘導(dǎo)物添加濃度設(shè)6個(gè)處理：0(CK)、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 g/L，優(yōu)化表面活性劑、生長(zhǎng)因子種類(lèi)和誘導(dǎo)物濃度。上述各處理均設(shè)3次重復(fù)，分別測(cè)定不同培養(yǎng)基成分各處理3次重復(fù)發(fā)酵液的酶活性，優(yōu)化培養(yǎng)基成分。

1.2.4 培養(yǎng)基組成優(yōu)化

據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選出最佳碳源蔗糖、氮源酵母膏、磷源 (1/2磷酸氫二鉀和1/2磷酸二氫鉀)、2種主要無(wú)機(jī)鹽(氯化鈣和硝酸鉀)、表面活性劑Tween-20和生長(zhǎng)因子玉米漿，設(shè)計(jì)7因素3水平(表1)正交試驗(yàn)，選用L18(37)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，重復(fù)3次，分別測(cè)定各組合3次重復(fù)發(fā)酵液酶活性，結(jié)果進(jìn)行直觀和方差分析，優(yōu)化培養(yǎng)基組成和酶活性。各正交試驗(yàn)組合均添加1.5 g/L黃芩苷誘導(dǎo)物。

表1 培養(yǎng)基組成正交試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)Table 1 The factors and levels for soforthogonal test of the fermentation medium

1.2.5 酶催化黃芩苷轉(zhuǎn)化初步試驗(yàn)

(1)酶催化黃芩苷轉(zhuǎn)化試驗(yàn)方法。采用試驗(yàn)最優(yōu)產(chǎn)酶培養(yǎng)基，添加50 g/L 80目黃芩粉，在試驗(yàn)最佳產(chǎn)酶條件下，進(jìn)行β-D-葡萄糖醛酸苷酶催化黃芩苷轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，于發(fā)酵0 h和72 h分別檢測(cè)發(fā)酵液黃芩苷和黃芩素含量，計(jì)算黃芩苷轉(zhuǎn)化率，重復(fù)3次。黃芩素轉(zhuǎn)化率=[(發(fā)酵72 h黃芩素含量-發(fā)酵0 h黃芩素含量)×1.651 7/發(fā)酵0 h黃芩苷含量]×100%(1.651 7為黃芩苷和黃芩素摩爾質(zhì)量之比)。(2)黃芩苷、黃芩素含量檢測(cè)方法。采用HPLC法，取適量發(fā)酵液，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，上清液用色譜級(jí)甲醇進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)曒腿?0 min，0.22 μm 聚偏氟乙烯微孔濾膜(F型)過(guò)濾，Agilent1260高效液相色譜檢測(cè)。色譜條件：色譜柱Eclipse XDB-C18 (250 mm×4.6 mm,5 μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相為甲醇∶水∶磷酸(55∶45∶0.04)。黃芩苷濃度在2～100 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，黃芩苷保留時(shí)間(tR=6.024 min)；黃芩素濃度在5～100 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，黃芩素保留時(shí)間(tR=8.317 min)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件one-way ANOVA程序進(jìn)行顯著性分析，采用Duncan氏法進(jìn)行處理間多重比較，P<0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1.1 發(fā)酵時(shí)間優(yōu)化

發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液酶活性影響結(jié)果(圖1)顯示：隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，酶活性先升后降，發(fā)酵時(shí)間為42 h時(shí)，酶活性最高，為36.43 U/mL，與其他發(fā)酵時(shí)間結(jié)果相比，均存在顯著差異。發(fā)酵時(shí)間從18 h到42 h，發(fā)酵液產(chǎn)酶量逐漸增加，不同發(fā)酵時(shí)間處理間酶活性均存在顯著差異。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酶活性的影響Figure 1 Effect of fermentation time on enzyme activity

2.1.2 培養(yǎng)轉(zhuǎn)速優(yōu)化

轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵液酶活性影響結(jié)果(圖2)顯示：隨轉(zhuǎn)速增加，酶活性不斷增加，轉(zhuǎn)速為240 r/min時(shí)，酶活性最高，為40.90 U/mL，與其他處理酶活性相比，均存在顯著差異。

圖2 轉(zhuǎn)速對(duì)酶活性的影響Figure 2 Effect of rotational speed on enzyme activity

2.1.3 裝液量?jī)?yōu)化

裝液量對(duì)發(fā)酵液酶活性影響結(jié)果(圖3)顯示：隨裝液量增加，酶活性不斷減小，裝液量為10%時(shí)，酶活性最高，為47.59 U/mL，裝液量為30%時(shí)，酶活性最低，為42.24 U/mL，10%裝液量酶活性與20%、25%和30%裝液量酶活性相比，均存在顯著差異。

圖3 裝液量對(duì)酶活性的影響Figure 3 Effect of liquid culture volume on enzyme activity

2.1.4 培養(yǎng)基初始pH優(yōu)化

初始pH對(duì)發(fā)酵液酶活性影響結(jié)果(圖4)顯示：隨初始pH值升高，酶活性相對(duì)穩(wěn)定而后急降，pH值為7.0時(shí)，酶活性最高，為48.71 U/mL，pH值為8.0時(shí)，酶活性顯著下降，為12.10 U/mL。

圖4 初始pH值對(duì)酶活性的影響Figure 4 Effect of initial pH on enzyme activity

2.1.5 發(fā)酵溫度優(yōu)化

溫度對(duì)發(fā)酵液酶活性影響結(jié)果(圖5)顯示：隨溫度升高，酶活性先增后減，溫度為35 ℃時(shí)，酶活性最高，為79.07 U/mL，與33 ℃處理酶活性相比無(wú)顯著差異，與其他處理相比均存在顯著差異；溫度為39 ℃時(shí)，酶活性為6.52 U/mL，與其他各處理相比均顯著下降。

圖5 溫度對(duì)酶活性的影響Figure 5 Effect of temperature on enzyme activity

2.1.6 接種量?jī)?yōu)化

接種量對(duì)發(fā)酵液酶活性影響結(jié)果(圖6)顯示：隨接種量增加，酶活性先升后降，接種量為4%時(shí)，酶活性最高，為79.51 U/mL，接種量為3%和5%時(shí)，酶活性較高，分別為75.72 U/mL和77.06 U/mL，且3%～5%接種量之間無(wú)顯著差異。4%接種量處理與1%和2%接種量處理相比，酶活性顯著增加；3%和5%接種量處理，與1%接種量處理相比，酶活性顯著增加。

圖6 接種量對(duì)酶活性的影響Figure 6 Effect of inoculation amount on enzyme activity

2.2 培養(yǎng)基成分優(yōu)化

2.2.1 碳源種類(lèi)優(yōu)化

碳源對(duì)發(fā)酵液酶活性影響結(jié)果(圖7)表明：蔗糖為碳源時(shí)，酶活性最高，為142.14 U/mL；淀粉為碳源時(shí)，酶活性較高，為105.71 U/mL；而紅糖、糖蜜為碳源時(shí)，酶活性差。各種碳源處理酶活性間均存在顯著差異，表明碳源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶具有重要影響作用，選擇最佳碳源種類(lèi)至關(guān)重要。

圖7 碳源對(duì)酶活性的影響Figure 7 Effect of carbon source on enzyme activity

2.2.2 氮源種類(lèi)優(yōu)化

氮源對(duì)發(fā)酵液酶活性影響結(jié)果(圖8)表明：酵母膏為氮源時(shí)，酶活性最高，為229.64 U/mL，與其他氮源處理相比，酶活性均顯著增加；蛋白胨、黃豆粉為碳源時(shí)，酶活性較高，分別為142.28 U/mL和87.61 U/mL，與其他氮源處理酶活性相比，均存在顯著差異，二者間亦存在顯著差異。其他氮源酶活性較差，且無(wú)顯著差異。

圖8 氮源對(duì)酶活性的影響Figure 8 Effect of nitrogen source on enzyme activity

2.2.3 磷源種類(lèi)優(yōu)化

磷源對(duì)發(fā)酵液酶活性影響見(jiàn)圖9：1/2磷酸二氫鉀+1/2磷酸氫二鉀為磷源時(shí)，酶活性最高，為189.43 U/mL；磷酸氫二鉀為磷源時(shí)，酶活性最低，為168.09 U/mL，與其他兩種磷源相比，存在顯著差異。

圖9 磷源對(duì)酶活性的影響Figure 9 Effect of phosphate source on enzyme activity

2.2.4 無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)優(yōu)化

無(wú)機(jī)鹽對(duì)發(fā)酵液酶活性影響結(jié)果(圖10)表明：氯化鈣、硝酸鉀、硫酸錳、三氯化鐵、硫酸銅和硫酸亞鐵為無(wú)機(jī)鹽時(shí)，酶活性較高，分別為368.36、359.65、332.24、332.24、327.56和326.17 U/mL，均優(yōu)于CK，且存在顯著差異。其他無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)處理酶活性低于CK。

圖10 無(wú)機(jī)鹽對(duì)酶活性的影響Figure 10 Effect of inorganic salts on enzyme activity

2.2.5 表面活性劑種類(lèi)優(yōu)化

表面活性劑對(duì)發(fā)酵液酶活性影響結(jié)果(圖11)表明：添加Tween-20、Tween-80、TritonX-100和PEG-400時(shí)，酶活性分別為407.66、404.07、403.56和389.06 U/mL，與CK相比均顯著增加；而添加SDS時(shí)，酶活性有所下降，與CK相比無(wú)顯著差異。

圖11 表面活性劑對(duì)酶活性的影響Figure 11 Effect of surfactant on enzyme activity

2.2.6 生長(zhǎng)因子種類(lèi)優(yōu)化

生長(zhǎng)因子對(duì)發(fā)酵液酶活性影響結(jié)果(圖12)表明：添加玉米漿、糖蜜和麥芽汁時(shí)，酶活性分別為448.65、412.32和432.54 U/mL，與CK相比，添加玉米漿和麥芽汁處理酶活性均顯著增加，而添加糖蜜處理無(wú)顯著差異。

圖12 生長(zhǎng)因子對(duì)酶活性的影響Figure 12 Effect of growth factor on enzyme activity

2.2.7 誘導(dǎo)物濃度優(yōu)化

誘導(dǎo)物濃度對(duì)發(fā)酵液酶活性影響(圖13)表明：誘導(dǎo)物濃度為0時(shí)，未檢測(cè)到酶活性；隨添加濃度升高，酶活性先升后稍降，添加濃度為1.5 g/L時(shí)，酶活性最高，為488.65 U/mL，與誘導(dǎo)物添加濃度為2.0 g/L處理相比無(wú)顯著差異，與其他誘導(dǎo)物濃度處理相比均顯著增加。

圖13 誘導(dǎo)物濃度對(duì)酶活性的影響Figure 13 Effect of induces concentration on enzyme activity

2.3 培養(yǎng)基組成優(yōu)化

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。極差分析表明：影響發(fā)酵液酶活性主次因素關(guān)系：A(蔗糖)>B(酵母膏)>G(玉米漿)>D(氯化鈣)>C(1/2磷酸氫二鉀和1/2磷酸二氫鉀)>E(硝酸鉀)>F(Tween-20)；因素最佳水平組合：A2B3C2D3E2F3G1；最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成：蔗糖8.0 g/L，酵母膏11.0 g/L，磷酸二氫鉀0.38 g/L，磷酸氫二鉀0.38 g/L，氯化鈣0.27 g/L，硝酸鉀0.20 g/L，Tween-20 2.0 mL/L，玉米漿1.0 mL/L。最佳培養(yǎng)基組合不在正交試驗(yàn)組合內(nèi)，3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明：發(fā)酵液酶活性達(dá)(935.50±14.01)U/mL。方差分析結(jié)果(表3)顯示：F蔗糖=48.723>F0.05(2，2)=9.28，蔗糖作用達(dá)顯著水平，應(yīng)嚴(yán)格控制其用量，其他因素未達(dá)顯著水平。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及直觀分析結(jié)果Table 2 Arrangements of orthogonal experiments and results of visual analysis

表3 正交試驗(yàn)方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal test

2.4 酶催化黃芩苷轉(zhuǎn)化初步試驗(yàn)

采用試驗(yàn)最優(yōu)發(fā)酵產(chǎn)酶工藝，在未對(duì)酶催化轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化條件下，發(fā)酵產(chǎn)酶催化轉(zhuǎn)化72 h，黃芩苷轉(zhuǎn)化率為31.20%±4.15%。下一步工作將對(duì)該酶催化黃芩苷轉(zhuǎn)化最適溫度、pH等酶學(xué)特性及料液比等轉(zhuǎn)化體系影響因素進(jìn)行深入研究，優(yōu)化和提升黃芩苷轉(zhuǎn)化率。

3 討論

發(fā)酵時(shí)間優(yōu)化試驗(yàn)中，發(fā)酵12 h之前發(fā)酵液未檢測(cè)到β-D-葡萄糖醛酸苷酶酶活性，12 h之后酶活性逐漸增加，初步判斷該酶合成類(lèi)型為滯后合成型，推測(cè)存在分解代謝物阻遏作用，在解除分解代謝物阻遏方面，有待進(jìn)一步深入研究。發(fā)酵12 h至42 h，發(fā)酵液酶活性顯著增加，之后發(fā)酵液酶活性有所下降，原因可能與發(fā)酵液營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少、菌體出現(xiàn)衰退衰亡、發(fā)酵液pH變化影響酶穩(wěn)定性有關(guān)[7]。培養(yǎng)基初始pH值在6.0～7.5，發(fā)酵液產(chǎn)酶量較高且穩(wěn)定；pH值為8.0時(shí)產(chǎn)酶量顯著下降，表明堿性環(huán)境不利于JY24菌株產(chǎn)酶及酶活性發(fā)揮。培養(yǎng)基初始pH值與細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖、發(fā)酵產(chǎn)酶關(guān)系密切，對(duì)菌體細(xì)胞膜通透性有直接影響，進(jìn)而影響細(xì)胞膜穩(wěn)定性及產(chǎn)酶活力[8]。發(fā)酵溫度35 ℃時(shí)，酶活性最高，進(jìn)一步提高溫度，酶活性則顯著下降。通常較低溫度可提高酶所對(duì)應(yīng)mRNA穩(wěn)定性，增加酶生物合成延續(xù)時(shí)間，提高產(chǎn)酶量；但溫度太低易影響細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖，減緩代謝速度，降低產(chǎn)酶量和延長(zhǎng)發(fā)酵周期[9]。

碳源優(yōu)化試驗(yàn)中，不同碳源發(fā)酵液酶活性間均存在顯著差異，蔗糖為碳源時(shí)，酶活性最高，表明蔗糖是影響發(fā)酵液產(chǎn)酶的關(guān)鍵因素。Ku等[5]對(duì)德氏乳桿菌Rh2產(chǎn)β-D-葡萄糖醛酸苷酶的66種培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加4%半乳糖產(chǎn)酶最佳。碳源優(yōu)化時(shí)一般應(yīng)考慮：菌株?duì)I養(yǎng)偏好選擇；碳源對(duì)酶合成的代謝調(diào)節(jié)功能(誘導(dǎo)作用和分解代謝物阻遏作用)[10]；原料來(lái)源是否充裕、價(jià)格是否低廉、有否影響發(fā)酵工藝等因素[11]。氮源優(yōu)化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)有機(jī)氮源產(chǎn)酶效果顯著優(yōu)于無(wú)機(jī)氮源，這與異養(yǎng)型微生物細(xì)胞生長(zhǎng)、繁殖和產(chǎn)酶一般要求有機(jī)氮源一致[12]，可能無(wú)機(jī)氮源易使培養(yǎng)基pH降低致酶穩(wěn)定性受影響有關(guān)。Chouiter等[1]報(bào)道樹(shù)舌靈芝產(chǎn)β-D-葡萄糖醛酸苷酶最佳碳、氮源分別是阿拉伯膠和酵母膏，最佳氮源酵母膏與試驗(yàn)結(jié)果一致，最佳碳源則不同，可能與產(chǎn)酶菌株差異有關(guān)。

無(wú)機(jī)鹽優(yōu)化試驗(yàn)中，與對(duì)照相比，分別添加0.002 mol/L氯化鈣、硝酸鉀、硫酸錳、三氯化鐵、硫酸銅和硫酸亞鐵對(duì)發(fā)酵液酶活性均有顯著促進(jìn)作用。無(wú)機(jī)鹽對(duì)細(xì)胞產(chǎn)酶有以下作用：構(gòu)成細(xì)胞主要組成元素，構(gòu)成酶分子組成元素，作為激活劑調(diào)節(jié)酶活性，起穩(wěn)定氧化還原電位和滲透壓作用。楊光等[13]研究表明Ca2+在0.5～10 mmol/L濃度范圍內(nèi)對(duì)β-葡萄糖醛酸苷酶具有激活作用；司磊[14]研究表明Ca2+、Mg2+和Cu2+對(duì)酶促反應(yīng)具有促進(jìn)作用，而Fe2+有抑制作用，Zn2+低與高濃度作用不一。綜上，Ca2+作用比較一致，對(duì)β-葡萄糖醛酸苷酶數(shù)量和活性表現(xiàn)促進(jìn)作用，其它金屬離子作用存在出入。表面活性劑優(yōu)化試驗(yàn)表明Tween 20產(chǎn)酶效果最佳。表面活性劑可增加細(xì)胞膜通透性，利于胞外酶分泌，提高產(chǎn)酶量。楊耀剛等[15]]研究報(bào)道Tween能夠增加底物與酶有效結(jié)合，提高纖維素酶熱穩(wěn)定性，且Tween 20強(qiáng)于Tween 80；β-D-葡萄糖醛酸苷酶主要來(lái)源于細(xì)菌和真菌，通常分2種：胞內(nèi)酶和胞外酶。JY24菌株產(chǎn)β-D-葡萄糖醛酸苷酶酶活檢測(cè)前期試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液上清酶活性較高，而菌體破碎后粗酶液幾乎檢測(cè)不到酶活力，判斷所產(chǎn)該酶為胞外酶，進(jìn)而在培養(yǎng)基成分優(yōu)化中，選擇添加表面活性劑進(jìn)行研究，以期增加細(xì)胞膜通透性和產(chǎn)酶量。目前，優(yōu)化微生物菌株產(chǎn)β-D-葡萄糖醛酸苷酶的研究報(bào)道較少，已有樹(shù)舌靈芝、畢赤酵母、產(chǎn)紫青霉和球毛殼菌產(chǎn)β-D-葡萄糖醛酸苷酶的工藝優(yōu)化報(bào)道[3-4]，該酶活性范圍1.09～2 356 U/mL，發(fā)酵產(chǎn)酶時(shí)間4～14 d，其結(jié)果與產(chǎn)酶菌株、酶促反應(yīng)底物及菌株重組與否等差異有關(guān)。綜上可知，試驗(yàn)菌株發(fā)酵1.75 d(42 h)，酶活性達(dá)935.50 U/mL，較優(yōu)化前提高25.68倍，與上述研究相比，酶活性處于中等水平，發(fā)酵產(chǎn)酶時(shí)間縮短2.25～12.25 d。

4 結(jié)論

雞源飼用枯草芽孢桿菌JY24菌株產(chǎn)β-D-葡萄糖醛酸苷酶最佳發(fā)酵工藝：產(chǎn)酶條件：發(fā)酵時(shí)間42 h，轉(zhuǎn)速240 r/min，裝液量10%，培養(yǎng)基初始pH 7.0，發(fā)酵溫度35 ℃，接種量4%；產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成：蔗糖8.0 g/L，酵母膏11.0 g/L，磷酸二氫鉀0.38 g/L，磷酸氫二鉀0.38 g/L，氯化鈣0.27 g/L，硝酸鉀0.20 g/L，Tween-20 2.0 mL/L，玉米漿1.0 mL/L，黃芩苷1.5 g/L。在最佳發(fā)酵工藝條件下，雞源飼用枯草芽孢桿菌JY24菌株產(chǎn)β-D-葡萄糖醛酸苷酶酶活性達(dá)935.50 U/mL，較優(yōu)化前提高25.68倍，發(fā)酵產(chǎn)酶時(shí)間縮短2.25～12.25 d，酶催化初步研究表明黃芩苷轉(zhuǎn)化率為31.20%。