陸文怡，戰(zhàn)春君，劉秀霞，詹錦玲，楊艷坤，白仲虎

(1.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122,2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，無(wú)錫 214122)

巴斯德畢赤酵母能夠利用甲醇作為唯一碳源和能源生長(zhǎng)。近年來(lái)，隨著基因工程技術(shù)的進(jìn)步和全基因組序列的公開(kāi)，畢赤酵母憑借其廣泛的真核蛋白修飾能力、目標(biāo)蛋白易分泌、胞外雜蛋白少、易于高密度培養(yǎng)等特性，逐漸被開(kāi)發(fā)成為外源蛋白表達(dá)最常用的宿主之一[1-4]。

以甲醇為唯一碳源時(shí)，畢赤酵母的醇氧化物酶Ⅰ(alcohol oxidase 1,AOX1)可高效表達(dá)[1]，因此AOX1的啟動(dòng)子(AOX1 promoter,PAOX1)作為表達(dá)外源蛋白的強(qiáng)啟動(dòng)子被廣泛應(yīng)用。然而，當(dāng)培養(yǎng)基中含有葡萄糖、甘油或乙醇等碳源時(shí)，PAOX1的活性會(huì)受到抑制[5]。戰(zhàn)春君等[6]將畢赤酵母中的甘油轉(zhuǎn)運(yùn)體1(Glyceroltransporter1,GT1)敲除后獲得突變株(P.pastorisΔGT1)，可以緩解甘油對(duì)PAOX1的抑制，AOX1酶在甘油或甘油甲醇混合培養(yǎng)基中均可獲得一定的組成型表達(dá)。因此P.pastorisΔGT1在工業(yè)生產(chǎn)中有著廣泛的應(yīng)用前景。用混合碳源培養(yǎng)畢赤酵母時(shí)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中甲醇含量越高，PAOX1表達(dá)水平越高，但是細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)會(huì)下降，使外源蛋白產(chǎn)量受到限制。所以明確甲醇對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用的內(nèi)在機(jī)理，對(duì)外源蛋白生產(chǎn)至關(guān)重要。

細(xì)胞的生長(zhǎng)與細(xì)胞自噬有著密不可分的關(guān)系，當(dāng)細(xì)胞遇到缺氧，缺營(yíng)養(yǎng)，細(xì)胞器損傷，細(xì)胞內(nèi)異常蛋白累積，某些微生物入侵，或接觸某些化學(xué)物質(zhì)時(shí)[7]，細(xì)胞自噬通過(guò)降解細(xì)胞內(nèi)組分，維持細(xì)胞內(nèi)生理平衡幫助細(xì)胞度過(guò)逆境[8]。細(xì)胞的自噬有很多種，根據(jù)目的降解物的不同又可以分成選擇性自噬和非選擇性自噬[9]。發(fā)現(xiàn)當(dāng)碳源發(fā)生改變的時(shí)候，巴斯德畢赤酵母中明顯變化的是宏自噬與過(guò)氧化物酶體自噬。宏自噬是一種非選擇性自噬，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)形成的雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體，非特異性地包裹損傷或者多余的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器,并遞送至液泡或溶酶體以分解和再循環(huán)[10]。而過(guò)氧化物酶體自噬是自噬體通過(guò)與受體ATG30結(jié)合，特異性地降解多余的過(guò)氧化物酶體的過(guò)程[11-12]。過(guò)氧化物酶體是巴斯德畢赤酵母中代謝甲醇或油酸必需的細(xì)胞器[13]，當(dāng)碳源改變，或者碳源利用率降低時(shí)，過(guò)氧化物酶體過(guò)剩，過(guò)氧化物酶體自噬上調(diào)，降解掉多余的過(guò)氧化物酶體。

本文通過(guò)檢測(cè)畢赤酵母在甲醇和甘油中的菌體密度和碳源代謝速度，以及自噬相關(guān)基因?qū)μ荚醋兓捻憫?yīng)，研究碳源對(duì)畢赤酵母細(xì)胞生長(zhǎng)代謝和自噬的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器和試劑

熒光分光光度計(jì)(上海棱光技術(shù)有限公司)，紫外分光光度計(jì)(上海棱光技術(shù)有限公司)，PCR 儀(朗基科儀)，電泳儀(北京六一儀器)，凝膠成像儀(美國(guó) Aplegen)，電轉(zhuǎn)儀(美國(guó) BIO-RAD 公司)，高通量破碎儀(Bertin Technologies)，高效液相色譜儀(日本島津公司)，有機(jī)酸柱(Shim-pack SCR-101H，日本島津公司)，qRT-PCR儀(美國(guó)Applied biosystem)，微量可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)Quawell)；DNA聚合酶、內(nèi)切酶、DNA連接酶、卡那霉素、博來(lái)霉素、G418抗生素、qRT-PCR試劑盒(Takara)，6×His標(biāo)簽抗體(Takara)，發(fā)光底物(Thermo Fisher Scientific)。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒

以畢赤酵母Pichiapastoris及突變株P(guān)ichiapastorisΔGT1為對(duì)象，研究細(xì)胞自噬對(duì)畢赤酵母生長(zhǎng)代謝的調(diào)控機(jī)理，涉及多個(gè)重組菌株的構(gòu)建。所用質(zhì)粒：pPICZB (Invitrogen)、pPic9-ARS-CEN-PHTX1-sgRNA (實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)。各重組菌株如表1所示。

表1 所用畢赤酵母及其突變株Table 1 Pichia pastoris and its mutants in this study

1.1.3 培養(yǎng)基

Luria-Bertani(LB)液體培養(yǎng)基(酵母提取物5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L；固體培養(yǎng)基加 2%瓊脂，121 ℃，20 min滅菌)；Low-salt LB (LLB)液體培養(yǎng)基(酵母提取物5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L；固體培養(yǎng)基加2%瓊脂，121 ℃，20 min滅菌)；Yeast Extract Peptone Dextrose(YPD/YEPD)液體培養(yǎng)基(酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，121℃滅菌20 min。冷卻至60 ℃后在超凈臺(tái)中加入碳源)；Bufffered Yeast-Extract Medium(BMY)液體培養(yǎng)基(酵母提取物 10 g/L，蛋白胨20 g/L，K2HPO43 g/L，KH2PO411.8 g/L，115 ℃滅菌30 min)；Glycerol Complex BMY (BMGY)液體培養(yǎng)基(在BMY液體培養(yǎng)基中加入1%的甘油)；Glycerol and Methanol Complex BMY (BMGMY)液體培養(yǎng)基(在BMY液體培養(yǎng)基中加入0.5%的甘油和0.5%的甲醇)；Methanol Complex BMY(BMMY)液體培養(yǎng)基(在BMY液體培養(yǎng)基中加入1%的甲醇)。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)

取甘油菌以1%～2%接種于5 mL的YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、230 r/min下活化16 h后離心收集全部菌體，用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液洗滌3次，按初始OD600=0.1接種于不同碳源的BMY培養(yǎng)基中，在30 ℃、230 r/min下培養(yǎng)，按不同的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)間取樣，測(cè)所需參數(shù)。

1.2.2 碳源消耗速度檢測(cè)(高效液相色譜法)

取培養(yǎng)基中發(fā)酵液，13 000 r/min高速離心10 min，收集上清液，200 μL的進(jìn)樣量裝入色譜進(jìn)樣瓶中檢測(cè)甲醇和甘油的濃度。色譜條件為：有機(jī)酸柱及示差折光檢測(cè)器，流動(dòng)相：5 mmol/L硫酸作，流速：0.5 mL/min，柱溫：30 ℃。

碳源的消耗速度計(jì)算公式V=(S0-St)/Δt，其中：S0為碳源初始濃度，St為t時(shí)刻碳源濃度，Δt為取樣間隔時(shí)長(zhǎng)。

1.2.3 基因表達(dá)定量檢測(cè)(實(shí)時(shí)熒光定量PCR，qRT-PCR)

分別在50 mL的BMMY和BMGY培養(yǎng)基中，30 ℃、230 r/min下培養(yǎng)WT和P.pastorisΔGT1菌株24 h后，每瓶培養(yǎng)液平均分成兩份，每份25 mL，離心收集菌體，用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液洗滌3次，再將每份菌體分別轉(zhuǎn)接到25 mL的BMMY和BMGY培養(yǎng)基中。在30 ℃、230 r/min 下發(fā)酵10 min 后，收集OD600=10的菌體，加入TRIZOL和玻璃珠，用高通量破碎儀對(duì)菌體進(jìn)行破碎。破碎后加入1/5 TRIZOL體積的氯仿析出RNA，溶液分為水相和有機(jī)相，RNA在水相中。取出水相，用相同體積的乙醇沉淀回收RNA，加入Buffer1，Buffer2清洗，最后加入適量RNase free水溶解。提取出的RNA經(jīng)核酸凝膠電泳驗(yàn)證，出現(xiàn)兩條帶，第一條帶亮度約是第二條的兩倍。用Takara的試劑進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR，檢測(cè)不同碳源培養(yǎng)下，樣品中與自噬相關(guān)基因：Atg8、Atg9、Pik3、Pka、Thiolase、Atg30、Pex14、Pex4和Pex5的相對(duì)表達(dá)量(Relative Quantity，RQ)的變化規(guī)律，RQ值采用StepOne Software的計(jì)算方式。

Cycle Threshold(Ct)值：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。

ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，

ΔΔCt=ΔCt目的樣品-ΔCt對(duì)照樣品，RQ=2-ΔΔCt。

1.2.4 菌株構(gòu)建

因畢赤酵母自噬相關(guān)研究較少，自噬相關(guān)蛋白均無(wú)商業(yè)化的特異性抗體。利用CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)，將蛋白標(biāo)簽(6×His)連在酵母染色體上目的基因的C端[14]，以檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。以pPic9-ARS-CEN-PHTX1-sgRNA(sgRNA表達(dá)質(zhì)粒)為模板，合成帶有目的基因的sgRNA序列(sgRNA片段由http://chopchop.cbu.uib.no/網(wǎng)站設(shè)計(jì))的pPic9-ARS-CEN-PHTX1-sgRNA質(zhì)粒的同源片段，再用同源重組將片段整合到質(zhì)粒上，構(gòu)建出可以敲除目的基因的sgRNA質(zhì)粒。以野生型菌株的基因組為模板，分別用引物up-F，up-R，down-F，down-R(up-R和down-F中含有6×His標(biāo)簽)將目的基因上下游同源臂擴(kuò)增出來(lái)，再將兩段同源臂融合，所用引物如表2所示，構(gòu)建含有6×His標(biāo)簽的目的基因的同源片段，如圖1所示。將sgRNA質(zhì)粒和同源片段轉(zhuǎn)化入P.pastorisCas9和P.pastorisΔGT1菌株中，培養(yǎng)組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選平板上的單克隆，并提取酵母基因組DNA，進(jìn)行PCR驗(yàn)證。PCR反應(yīng)所用引物F為基因組DNA上目的基因的上游序列，引物R為重組片段6×His標(biāo)簽附近序列，因此只有重組成功的轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增出特異性的PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳分析，篩選目的基因后連上了6×His標(biāo)簽的突變株進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

表2 合成同源臂所用引物Table 2 Primers for construction homologous DNA fragment

圖1 同源臂構(gòu)建Figure 1 Construction of homologous DNA fragment

1.2.5 蛋白表達(dá)量檢測(cè)(化學(xué)發(fā)光法)

用1.2.3節(jié)相同的方式培養(yǎng)，相同的時(shí)間取樣，收集OD600=10的菌體提取蛋白,加入與菌體等量的酸性玻璃珠和預(yù)冷的PEB酵母裂解液(含PMSF)重懸細(xì)胞，振蕩破碎菌體后離心吸取上清至潔凈的Eppendorf 管中，-20 ℃保存。經(jīng)過(guò)Bradford法蛋白質(zhì)定量之后將樣品固定在塑膠孔盤上，封閉液封閉，加入6×His標(biāo)簽的抗體，最后加發(fā)光底物用酶標(biāo)儀讀出每孔的相對(duì)光單位(relative light unit,RLU)，即可表征蛋白的表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源培養(yǎng)對(duì)畢赤酵母代謝的影響

分別在BMMY、BMGY和BMGMY等3種不同碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)WT和P.pastorisΔGT1菌株，每隔 6 h取樣，收集上清發(fā)酵液，通過(guò)高效液相色譜儀，分析發(fā)酵液中碳源的消耗情況，計(jì)算細(xì)胞對(duì)碳源的利用速度，結(jié)果如圖2和圖3所示。畢赤酵母以甲醇為單一碳源培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞對(duì)碳源的代謝速度明顯低于以甘油為單一碳源。在甘油和甲醇的混合碳源培養(yǎng)基中，甘油會(huì)抑制WT菌株的甲醇代謝，所以細(xì)胞對(duì)甲醇的利用率明顯低于甘油；P.pastorisΔGT1菌株在對(duì)數(shù)期前會(huì)優(yōu)先利用甘油，在對(duì)數(shù)期后細(xì)胞對(duì)甲醇的利用率大幅度提升，由于敲除了甘油轉(zhuǎn)運(yùn)體，細(xì)胞對(duì)甲醇的偏好明顯高于甘油。證明單一碳源培養(yǎng)時(shí)，畢赤酵母細(xì)胞對(duì)甲醇的利用速度比甘油低，在甲醇培養(yǎng)基中，細(xì)胞代謝比在甘油培養(yǎng)基慢。混合碳源培養(yǎng)時(shí)，由于甘油抑制了畢赤酵母對(duì)甲醇的代謝，所以WT菌株傾向于代謝甘油，而P.pastorisΔGT1菌株解除了甘油對(duì)甲醇代謝的抑制，則優(yōu)先選擇利用甲醇進(jìn)行代謝。

圖2 單一碳源培養(yǎng)基中P. pastoris ΔGT1(a)和WT(b)對(duì)碳源的消耗速度Figure 2 Utilization rate of carbon source of P. pastoris ΔGT1 (a)and WT(b)in sole carbon source medium

圖3 BMGMY培養(yǎng)基中P. pastoris ΔGT1(a)和WT(b)對(duì)碳源的消耗速度Figure 3 Utilization rate of carbon source of P. pastoris ΔGT1 (a)and WT(b)in BMGMY

2.2 不同碳源培養(yǎng)對(duì)畢赤酵母生長(zhǎng)狀況的影響。

以甲醇或甘油為單一碳源培養(yǎng)的酵母，在100倍生物顯微鏡下的細(xì)胞狀態(tài)如圖4所示。發(fā)現(xiàn)畢赤酵母在甲醇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，細(xì)胞干癟且破損率高，在甘油培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，細(xì)胞圓潤(rùn)飽滿。

圖4 畢赤酵母在不同碳源中的細(xì)胞形態(tài)Figure 4 Morphology of Pichia pastoris using different carbon sources

在BMMY、BMGY和BMGMY等3種不同碳源培養(yǎng)基中培養(yǎng)WT和P.pastorisΔGT1菌株，從12 h開(kāi)始，每隔6 h取樣，測(cè)OD600并繪制生長(zhǎng)曲線，如圖5所示。WT和P.pastorisΔGT1菌株以甲醇為碳源生長(zhǎng)時(shí)，菌株生長(zhǎng)密度比以甘油為碳源時(shí)低。并且在混合碳源培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，菌株的生長(zhǎng)密度依舊不如以甘油為唯一碳源培養(yǎng)的菌株。綜上證明畢赤酵母在甲醇中生長(zhǎng)狀態(tài)不如甘油，并且只要細(xì)胞代謝甲醇，生長(zhǎng)狀態(tài)就會(huì)下降，甘油比甲醇更有利于畢赤酵母的生長(zhǎng)。

圖5 不同碳源的培養(yǎng)基中P. pastoris ΔGT1(a)和WT(b)的生長(zhǎng)曲線Figure 5 Growth curve of P. pastoris ΔGT1(a)and WT(b)using different carbon sources

2.3 不同碳源培養(yǎng)對(duì)畢赤酵母細(xì)胞自噬的影響

按1.2.3節(jié)所述的培養(yǎng)方法，得到4瓶培養(yǎng)液：碳源從甘油轉(zhuǎn)到新的甘油(Glycerol→Glycerol)，碳源從甘油轉(zhuǎn)到新的甲醇(Glycerol→MeOH)，碳源從甲醇轉(zhuǎn)到新的甘油(MeOH→Glycerol)，碳源從甲醇轉(zhuǎn)到新的甲醇(MeOH→MeOH)，取培養(yǎng)液中發(fā)酵10 min 后的樣品。通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)自噬相關(guān)基因的表達(dá)量隨碳源改變發(fā)生明顯變化。Atg8：宏自噬過(guò)程中，自噬體膜上負(fù)責(zé)自噬體與液泡融合的蛋白，在自噬被誘導(dǎo)發(fā)生后表達(dá)量增加10到20倍，是酵母細(xì)胞內(nèi)自噬研究中常用的標(biāo)記物[14-15]；Atg30：過(guò)氧化物酶體自噬過(guò)程中，自噬體特異性識(shí)別過(guò)氧化物酶體必需的受體因子，是酵母細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化物酶體自噬研究中常用的表征物[11-12]。結(jié)果如圖6～圖8所示。

無(wú)論初始碳源是甘油還是甲醇，當(dāng)碳源換成甲醇時(shí)，WT菌株和P.pastorisΔGT1菌株內(nèi)Atg8基因的表達(dá)量均比碳源換成甘油時(shí)高(圖6)。說(shuō)明在甲醇培養(yǎng)基中，細(xì)胞內(nèi)宏自噬水平高。在逆境中，宏自噬通過(guò)分解細(xì)胞內(nèi)的多余組分維持細(xì)胞基本穩(wěn)態(tài)，結(jié)合圖4和圖5的結(jié)果可以證明，甲醇能夠誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)宏自噬水平提高，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)下降，生長(zhǎng)速度變緩，不同碳源可以通過(guò)調(diào)節(jié)宏自噬水平影響細(xì)胞生長(zhǎng)。

*** 為P<0.01;** 為0.01

無(wú)論初始碳源是甘油還是甲醇，當(dāng)碳源換成甲醇時(shí)，WT菌株和P.pastorisΔGT1菌株內(nèi)Atg30基因的表達(dá)量均比碳源換成甘油時(shí)低(圖7)。說(shuō)明在甲醇培養(yǎng)基中，細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化物酶體自噬水平低。結(jié)合圖2和圖3的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甘油中細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化物酶體自噬水平高，過(guò)氧化物酶體被分解利用為其他代謝通路的組分提供“營(yíng)養(yǎng)”，從而甘油代謝速度加快；混合碳源中P.pastorisΔGT1菌株解除了甘油抑制后，過(guò)氧化物酶體自噬水平的抑制增加了細(xì)胞對(duì)甲醇的代謝。因此證明不同碳源通過(guò)調(diào)節(jié)過(guò)氧化物酶體自噬水平影響細(xì)胞代謝。

圖 6和圖 7顯示，無(wú)論初始碳源是甘油還是甲醇，當(dāng)碳源變成甲醇(ICS→MeOH)時(shí)，WT和P.pastorisΔGT1菌株中Atg8的表達(dá)量相較于碳源變成甘油(ICS→Glycerol)時(shí)均增加，Atg30的表達(dá)量均降低，但是兩種菌株內(nèi)Atg8和Atg30表達(dá)量的變化程度不同。用細(xì)胞從初始碳源(甘油或者甲醇)轉(zhuǎn)接到甘油中基因的表達(dá)量與細(xì)胞從初始碳源(甘油或甲醇)轉(zhuǎn)接到甲醇中基因的表達(dá)量的差值的絕對(duì)值(|RQICS→Glycerol-RQICS→MeOH|)來(lái)表征不同碳源引起的基因表達(dá)量變化的差異。結(jié)果如圖8所示，P.pastorisΔGT1菌株內(nèi)不同碳源引起的Atg8基因和Atg30基因表達(dá)量的差異顯著低于WT菌株Atg8基因和Atg30基因表達(dá)量的差異，說(shuō)明P.pastorisΔGT1菌株內(nèi)宏自噬和過(guò)氧化物酶體自噬通量在不同碳源中的差異比WT小。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果從自噬角度論證敲除GT1基因能解除甘油對(duì)甲醇代謝的抑制，減小P.pastorisΔGT1胞內(nèi)兩種碳源代謝的矛盾和差異性。

*** 為P<0.01;** 為0.01

*** 為P<0.01;** 為0.01

2.4 蛋白表達(dá)水平驗(yàn)證

為進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)論，從蛋白表達(dá)水平檢測(cè)ATG8和ATG30響應(yīng)碳源變化的情況。因無(wú)商業(yè)化抗體，ATG8蛋白和ATG30蛋白后需連上合適的抗原標(biāo)簽才能進(jìn)行檢測(cè)。

通過(guò)胞內(nèi)同源重組的方式，用帶有6×His標(biāo)簽序列的同源臂替換原基因，可在目的蛋白后連上6×His標(biāo)簽。但是畢赤酵母細(xì)胞同源重組概率低，打靶效率可低至0.1%[16]，因此，在構(gòu)建突變株時(shí)增加了CRISPR/Cas9敲除系統(tǒng)，利用敲除質(zhì)粒在目的基因的sgRNA序列靶向位點(diǎn)處形成DNA雙鏈斷裂，增加細(xì)胞內(nèi)同源重組修復(fù)概率，提高畢赤酵母細(xì)胞同源重組編輯技術(shù)的效率[17]，原理如圖9所示。

將帶有目標(biāo)基因sgRNA片段的質(zhì)粒和帶有6×His標(biāo)簽的同源臂片段轉(zhuǎn)化至P.pastorisCas9和P.pastorisΔGT1菌株，按1.2.4節(jié)所述的方法進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖10所示，可以擴(kuò)增出800 bp左右的條帶的轉(zhuǎn)化子即為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，而未發(fā)生同源重組的轉(zhuǎn)化子無(wú)法擴(kuò)增出條帶。經(jīng)進(jìn)一步測(cè)序驗(yàn)證P.pastorisAtg8:6×His，P.pastorisΔGT1-Atg8:6×His，P.pastorisAtg30:6×His和P.pastorisΔGT1-Atg30:6×His 4株在標(biāo)簽連接的突變株構(gòu)建完成。本文創(chuàng)新性地將最新的CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)和同源重組技術(shù)聯(lián)用，使細(xì)胞內(nèi)同源重組概率(陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子個(gè)數(shù)/總轉(zhuǎn)化子個(gè)數(shù))達(dá)到22%～33%(圖10)，有效降低了同源重組改造的篩選難度。

標(biāo)簽連接完成后，按1.2.5節(jié)所述的方法檢測(cè)樣品中蛋白ATG8和ATG30的表達(dá)量，結(jié)果如圖11～圖13所示。

圖11和圖12的結(jié)果顯示，當(dāng)碳源換成甲醇時(shí)，WT和P.pastorisΔGT1菌株內(nèi)ATG8蛋白的表達(dá)量比碳源換成甘油時(shí)高；ATG30的蛋白表達(dá)量比碳源換成甘油時(shí)低，說(shuō)明蛋白表達(dá)受碳源調(diào)控的變化規(guī)律與基因表達(dá)一致。本文從蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步證明，畢赤酵母在甲醇培養(yǎng)基中細(xì)胞內(nèi)宏自噬水平上調(diào)，細(xì)胞生長(zhǎng)速率被抑制；過(guò)氧化物酶體自噬水平下降，過(guò)氧化物酶體累積，甲醇代謝加快。圖 13顯示，P.pastorisΔGT1菌株轉(zhuǎn)接到不同碳源時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ATG8蛋白和ATG30蛋白的表達(dá)量變化的差異同樣低于WT菌株，在蛋白表達(dá)水平上進(jìn)一步證明敲除GT1基因可以降低甘油和甲醇對(duì)細(xì)胞的自噬調(diào)控的差異。

*** 為P<0.01;** 為0.01

*** 為P<0.01;** 為0.01

*** 為P<0.01;** 為0.01

3 討論與結(jié)論

巴斯德畢赤酵母作為一種高效的表達(dá)外源蛋白的真核系統(tǒng)，已經(jīng)被廣泛地研究和利用。但是細(xì)胞在甲醇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀態(tài)不佳，很大地局限了畢赤酵母利用甲醇代謝進(jìn)行發(fā)酵。為進(jìn)一步分析原因，提高酵母的發(fā)酵產(chǎn)率，本文發(fā)現(xiàn)了自噬這一重要的調(diào)控途徑。不僅確定了甲醇能通過(guò)調(diào)控自噬水平影響細(xì)胞生長(zhǎng)代謝，還闡明了具體調(diào)控方法：提高細(xì)胞宏自噬水平，使細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制；降低細(xì)胞過(guò)氧化物酶體自噬水平，從而累積AOX1，提高AOX1酶活。這一發(fā)現(xiàn)為畢赤酵母內(nèi)甲醇利用系統(tǒng)的改善和菌種的優(yōu)化改造提供了新的思路。后期在此基礎(chǔ)上通過(guò)基因操作人工調(diào)節(jié)自噬途徑，有望得到更好生長(zhǎng)且更高效利用甲醇發(fā)酵生產(chǎn)蛋白的菌株，因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果在巴斯德畢赤酵母外源蛋白表達(dá)的工業(yè)應(yīng)用中具有重要價(jià)值。

此外，P.pastorisΔGT1菌株擁有廣泛的應(yīng)用前景，在研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)碳源轉(zhuǎn)變?yōu)榧状紩r(shí)，細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化物酶體自噬通量會(huì)減少，宏自噬通量會(huì)增加，而P.pastorisΔGT1菌株內(nèi)細(xì)胞自噬通量的改變幅度顯著低于野生型菌株。這一結(jié)果揭露了一條新的P.pastorisΔGT1菌株影響的細(xì)胞代謝途徑，從一個(gè)新的角度解釋了GT1的缺失對(duì)酶活的影響。