胡 睿，郭建秀，郭小強，陳鳳穎，王萬軍

(西南交通大學 生命科學與工程學院，成都610031)

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraetMigo)，是國家中藥材保護品種，多年生附生草本蘭科石斛屬植物，主要分布于中國云南、貴州、四川等地。藥用價值很高，具有益胃生津、滋陰清熱、潤肺止咳、明目強身等功效。且鐵皮石斛的全基因組的測序工作已經(jīng)完成，有利于在分子層面上進行進一步的探索[1]。鐵皮石斛的種子小、無胚乳，導致天然環(huán)境下難栽培，需要研究鐵皮石斛的種胚萌發(fā)調(diào)控機制來更好地繁育鐵皮石斛。形成原球莖是蘭科植物特有重新啟動細胞分裂的發(fā)育模式，對蘭科植物的種胚萌發(fā)調(diào)控起重要作用，因此需要探究影響原球莖形成的分子機制。

據(jù)報道，TIFY基因能夠調(diào)控植物的生長發(fā)育過程。TIFY是一類植物特異性轉(zhuǎn)錄因子家族。最初被報告為鋅指蛋白ZIM(At4g24470)，后因高度保守的TIFY結(jié)構域而被劃分為TIFY家族。TIFY結(jié)構域包含約28個氨基酸，核心基序為TIF[F/Y]XG。TIFY家族分為4個亞族：TIFY、JAZ、PPD和ZML[2]。除均包含高度保守的TIFY結(jié)構域外，JAZ亞族包含Jas域，也稱為CCT_2域[3]，PPD亞族包含截短的Jas域和PPD域，ZML亞族包含CCT域和ZML域[4]。

植物發(fā)育階段會激活JAZ蛋白的表達。在番茄中，SlJAZ2是從營養(yǎng)生長向生殖生長過渡的重要調(diào)節(jié)劑[5]。OsTIFY3/OsJAZ1可以通過與水稻中的OsMYC2和OsCOI1b相互作用來調(diào)節(jié)花的發(fā)育和根的伸長，而OsJAZ1核心部分的取代或缺失會影響花和根發(fā)育過程中JA信號的特異性和敏感性。另一個水稻JAZ基因OsTIFY11b/OsJAZ10可以通過增強莖中碳水化合物的積累來增加粒大小[6]。AtTIFY4a(PPD1)和AtTIFY4b(PPD2)參與葉生長的協(xié)調(diào)，調(diào)節(jié)葉片的大小并限制葉片的彎曲度。豆科直系同源基因PPD BIG SEEDS1調(diào)節(jié)細胞的增殖和植物器官大小[7]。同時TIFY基因?qū)Ψ巧锩{迫有反應，研究表明，TIFY基因通過SCFCOI1的 26S蛋白酶體途徑降解JA，消除JA響應基因的抑制。

近年來，對JAZ亞族研究較多，且大多數(shù)通過擬南芥和水稻進行了功能驗證[7-9]。但TIFY基因家族對鐵皮石斛原球莖發(fā)育過程中的調(diào)控機制還不甚清楚，且鐵皮石斛中該基因家族的全基因組信息還有待分析。鑒于此，作者分析鐵皮石斛的TIFY家族基因的系統(tǒng)發(fā)育關系以及蛋白質(zhì)和基因結(jié)構，為進一步了解TIFY基因在鐵皮石斛原球莖發(fā)育過程中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraetMigo)植株及種子為實驗室自育、自繁，成熟果莢采摘后經(jīng)無菌處理，將其種子散鋪于1/2MS固體培養(yǎng)基表面、放置在 (26±1)℃的無菌培養(yǎng)室中誘導種子萌發(fā)形成原球莖，并在 LEICAM165C 體視顯微鏡下分別收集處于種胚活化并突破種皮期(seed embryo activation and breakthrough testa,P1)、原球莖形成期(protocorm,P2)、原分生組織形成期(promeristem,P3)、頂端分生組織形成期(SAM,P4)、橢球型原球莖時期(spheroidicity protocorm,P5)、葉原基維管系統(tǒng)形成期(leaf primordium and vascular system,P6)、根端分生組織形成期(RAM,P7)[8]等7個時期的原球莖材料，經(jīng)液氮速凍后置于-80 ℃冷凍冰箱中凍存待用。

1.2 方法

1.2.1 鐵皮石斛DoTIFY基因家族的鑒定

利用SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫收集擬南芥TIFY蛋白序列(AtTIFY)和水稻蛋白序列(OsTIFY)；在中草藥組學數(shù)據(jù)庫 (http://202.203.187.112/herbalplant/)中獲取鐵皮石斛基因組序列。

利用AtTIFY和OsTIFY序列l(wèi)ocal BLASTP在GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索鐵皮石斛TIFY序列；通過隱馬爾科夫模型(HMM)篩選TIFY家族序列，其中包括TIFY域(Pfam:PF06200)、CCT域(Pfam:PF06203)、Jas域(也稱CCT2域)(Pfam:PF09425)和GATA結(jié)構域(Pfam:PF00320)(e<0.01)[9]；合并結(jié)果，去冗余，利用NCBI-CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)鑒定保守結(jié)構域，去除不含TIFY域的蛋白序列，獲得鐵皮石斛TIFY家族成員(DoTIFYs)序列。利用ExPASy工具分析鐵皮石斛TIFY蛋白家族的分子質(zhì)量(MW)、等電點(pI)、總平均親疏水性(GRAVY)等；使用Softberry的ProtComp 9.0(http://linux1.softberry.com/berry.phtml)和Cell-PLoc 2.0的Plant-mPLoc(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf)預測TIFY基因家族蛋白的亞細胞定位。

1.2.2 保守基序分布、基因結(jié)構分析和系統(tǒng)發(fā)育分析

利用MEME (http://meme-suite.org/)對DoTIFYs蛋白序列進行保守基序鑒定[10]；根據(jù)基因組gff3格式的原始注釋文件，使用TBtools對DoTIFYs的CDS進行注釋[11]；利用PlantCARE對DoTIFYs基因啟動子順式作用元件進行分析；MEGA 7.0的MUSCLE程序?qū)﹁F皮石斛、擬南芥、水稻、陸地棉和向日葵TIFY家族蛋白進行多序列比對，并構建最大似然(ML)樹(bootstrap值設置為1 000次)[12]。

1.2.3 鐵皮石斛轉(zhuǎn)錄組RNA-seq數(shù)據(jù)分析

收集處于P1～P5時期的鐵皮石斛原球莖、并使用Trizol法提取總RNA，每個時期設置3個重復，共15個樣品。用Nanodrop檢測總RNA的純度(OD260/280,OD260/230)，使用 Agilent 2100 檢測總RNA 的 RIN 值、28S/18S、圖譜基線、5S峰；使用電泳排除RNA樣品的基因組污染。將符合要求的總RNA進行Illumina HiSeq TM 4000轉(zhuǎn)錄組測序。

1.2.4 鐵皮石斛實時定量RT-PCR分析

用植物RNA提取試劑盒(成都百菲特)提取鐵皮石斛原球莖各時期的總RNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，酶標儀測定總RNA含量與OD260/280。以總RNA為模板，使用逆轉(zhuǎn)錄酶Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-,TaKaRa)體系和引物Oligo(dT)18進行逆轉(zhuǎn)錄反應。設計DoTIFY基因的qRT-PCR引物(表1)，測序驗證其cDNA模板無誤后在LightCycler 96 (Roche)上進行定量分析；以DoACTIN和DoGAPDH為參考基因，3次重復；用2-ΔΔCT方法計算DoTIFY的相對表達量[13]。

表1 qRT-PCR所用引物Table 1 Primers of qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛TIFY基因的全基因組鑒定

從鐵皮石斛基因組中共鑒定出20個DoTIFY家族基因(表2)。在構建進化樹時發(fā)現(xiàn)有一個DoTIFY(Dendrobium_GLEAN_10066219)與擬南芥、陸地棉和向日葵的PPD蛋白聚為一類，但不含有截短的Jas域，因此根據(jù)基因組注釋向后尋找了5 000 bp，經(jīng)過Softberry的fgenesh-m和單子葉植物(大麥、水稻、玉米)的HMM模型比對，將結(jié)果通過NCBI-CDD進行保守域的鑒定找到了后面的截短的Jas域，矯正了鐵皮石斛的TIFY家族的基因注釋。

表2 在鐵皮石斛基因組中鑒定出的DoTIFY家族基因Table 2 DoTIFY family genes identified in D.officinale

結(jié)果表明，TIFY家族成員的氨基酸序列長度從142 aa (DoJAZ11)到517 aa (DoJAZ13)，理論分子質(zhì)量從13.79 ku (DoJAZ6)到57.00 ku (DoJAZ13)，pI從5.3 (DoPPD1)到9.54 (DoTIFY1)。所有TIFY蛋白都定位在細胞核中。

2.2 鐵皮石斛TIFY基因家族的系統(tǒng)發(fā)育特征

在GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得擬南芥、水稻、陸地棉和向日葵的共68條TIFY蛋白序列。與DoTIFY進行系統(tǒng)發(fā)育分析(MEGA7.0)。結(jié)果(圖1)顯示，JAZ亞家族最多，鐵皮石斛的TIFY蛋白成員在進化親緣性上更偏向于同為單子葉植物的水稻。PPD蛋白構成獨特的進化枝，包括擬南芥(AtPPD1和AtPPD2)，陸地棉(GaPPD1和GaPPD2)，向日葵(HaPPD1和HaPPD2)和僅一個鐵皮石斛(DoPPD1)。

圖1 不同物種TIFY蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析Figure 1 The phylogenetic tree of TIFY protein sequences from different plants

2.3 鐵皮石斛TIFY基因家族的保守基序和保守結(jié)構域分析

蛋白質(zhì)序列分析表明，所有鐵皮石斛TIFY蛋白在TIFYXG的氨基酸水平上普遍具有保守性。DoJAZ和DoZML的保守序列是SLXRF(L/F,E/Q)KRKXRX5PY和SLXRFR(E/Q)KRKXRX7Y，DoPPD包含一個截短的Jas基序，缺少保守的P、Y殘基。

通過MEME在線工具分析鐵皮石斛TIFY蛋白保守域，鑒定出10個保守基序。其中，motif1和3、motif 1和6、motif 1和7組成TIFY域，大部分的TIFY域由motif 1和3組成。motif 2為Jas域(圖2)。另外，motif 4被注釋為ZnF_GATA結(jié)構域，基序2和3組成CCT域。

(a)基于進化關系的DoTIFY的保守域(不同的基序用不同的顏色表示，每種蛋白質(zhì)中基序的長度按比例顯示)；(b)TIFY域的保守基序;(c)Jas域的保守基序;(d)CCT域的保守基序。圖2 DoTIFY的保守基序分析Figure 2 Conserved motif analysis of DoTIFY

2.4 鐵皮石斛TIFY基因家族的基因結(jié)構分析

通過繪制基因結(jié)構和蛋白質(zhì)保守結(jié)構域圖，在DoTIFY基因上游調(diào)控區(qū)(2 kb)預測啟動子元件(TATA框、CAAT框)，見圖3。發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的保守結(jié)構域和外顯子在基因序列上的位置并不完全一致。DoTIFY基因家族成員包含1～8個外顯子，每個亞科的外顯子數(shù)量各不相同。

圖3 DoTIFY的基因結(jié)構和蛋白質(zhì)保守域分析Figure 3 Analysis of DoTIFY gene structure and protein conserved domain

2.5 鐵皮石斛TIFY基因家族的順式作用元件分析

基因5′上游區(qū)域的順式作用元件中有TF的結(jié)合位點，負責轉(zhuǎn)錄調(diào)控[14]。提取DoTIFY基因上游2 kb預測調(diào)控元件(圖4)。參考經(jīng)過實驗驗證的25種植物(擬南芥、水稻、番茄等)中啟動子區(qū)域的順式作用元件，預測到鐵皮石斛TIFY基因家族存在大量的順式作用元件，主要有與植物激素、與生長發(fā)育、與晝夜節(jié)律光響應、與缺氧厭氧誘導、與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點以及與脅迫反應相關。每個TIFY基因家族的成員都能在多個不同位點預測到光響應(chs-CMA1a、LAMP-element、Sp1等)和與脅迫反應(DRE、MYB、MYC等)相關的順式作用元件，其中與茉莉酸、脫落酸、赤霉素和水楊酸相關元件(TGACG-motif、CGTCA-motif、ABR等)和與生長發(fā)育相關的順式作用元件(TGA-element、CAT-box等)，雖然不是在每個TIFY基因家族的成員中都能預測到，但仍然大量存在。該結(jié)果表明，DoTIFY基因在鐵皮石斛的生長發(fā)育過程以及對植物激素和非生物脅迫的響應中具有重要作用。

圖4 DoTIFY的順式作用元件分析Figure 4 Analysis of DoTIFY cis-acting element

2.6 鐵皮石斛TIFY基因家族在原球莖發(fā)育過程中表達分析

對鐵皮石解5個不同時期、3個生物學重復共15個樣品的原球莖進行Illumina RNA-seq測序，共得到106.81 Gb Clean Data，Q30 達到 91.20%。重復樣本間相關系數(shù)r>0.9。組裝后得到21 572個完整ORF序列、并完成27 107個新轉(zhuǎn)錄本的功能注釋。

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，DoTIFY基因家族的BLAST結(jié)果和轉(zhuǎn)錄組RNA-seq數(shù)據(jù)一致，繪制了鐵皮石解原球莖不同時期發(fā)育過程中DoTIFY的表達譜(圖5)。結(jié)果顯示，在鐵皮石解原球莖發(fā)育過程中11個DoJAZ基因差異表達。在原球莖發(fā)育過程中，DoJAZ5和DoJAZ6在P1～P5時期顯示先明顯上調(diào)再明顯下調(diào)最終緩慢上調(diào)。DoJAZ3、DoJAZ9和DoJAZ10在P1～P2時期顯示低表達明顯上調(diào)，在P4～P6時期高表達緩慢上調(diào)。DoJAZ8和DoJAZ15在P1～P3時期顯示低表達緩慢上調(diào)，P4～P6時期低表達下調(diào)。而DoJAZ7、DoJAZ14、DoJAZ2和DoJAZ4在P1～P5時期顯示低表達上調(diào)，表明這些基因可能在鐵皮石解原球莖發(fā)育中起作用。

圖5 轉(zhuǎn)錄組中差異表達的11個DoTIFYFigure 5 Eleven DoTIFYs differentially expressed in the RNA-seq

為深入了解DoTIFY基因在各種組織中的表達譜，選定4個DoTIFY基因(DoJAZ3、DoJAZ8、DoJAZ5和DoJAZ6)在鐵皮石解原球莖發(fā)育的7個不同時期進行了qRT-PCR分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這4種DoTIFY基因在7個不同時期的表達模式與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)大致相同(圖6)。

P1～P7 分別代表鐵皮石斛種胚活化期，原球莖形成，原分生組織形成，頂端分生組織形成，橢球形原球莖時期、葉原基維管系統(tǒng)形成和根端分生組織形成時期。圖6 原球莖不同發(fā)育時期4個DoTIFY基因表達分析Figure 6 The relative expression levels of four DoTIFYs in 7 development stages of protocorm

3 討論與結(jié)論

研究從鐵皮石斛的基因組中系統(tǒng)地鑒定了20個DoTIFY基因。鑒定過程矯正了基因組注釋中一個DoTIFY基因缺少的一段CDS，完善了注釋信息。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示TIFY蛋白以單子葉植物或雙子葉植物特異性模式簇集(圖1)。通過MEME進一步檢測到10個保守基序分布在不同的亞族中(圖2)，這可能有助于TIFY蛋白功能的多樣化。研究中DoJAZ基因的外顯子/內(nèi)含子表現(xiàn)出高變異性，表明在進化過程中發(fā)生了變化，由此推測JAZ亞家族中的蛋白質(zhì)可能具有不同的功能，而DoZML亞家族成員中均有7～8個外顯子，在進化過程中高度保守，外顯子和內(nèi)含子數(shù)量的保守性與系統(tǒng)發(fā)育樹的進化枝高度相關，這有力地支持了TIFY基因的緊密進化關系。

值得注意的是，所有的DoTIFY基因啟動子中均預測到大量的不同功能的順式作用元件(圖4)，表明TIFY基因可能參與了鐵皮石斛的生長和發(fā)育的許多過程。ZML家族和JAZ家族在鐵皮石斛的生長和發(fā)育的過程中可能起不同的作用，而JAZ亞家族中預測到的啟動子功能與系統(tǒng)進化的關系緊密，推測JAZ家族在進化過程中功能可能出現(xiàn)了分化。

DoTIFY在原球莖發(fā)育時期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及定量表達驗證，表明了不同的DoJAZ蛋白在原球莖發(fā)育時期有不同的表達模式，這證明了JAZ蛋白功能的多樣性。不同的JAZ蛋白通過不同的信號傳導途徑或與不同的蛋白互作，影響著鐵皮石斛原球莖的發(fā)育。