文/ 陳世鵬 董炎超

為驗(yàn)證蒸汽滅菌器的滅菌效果——我們設(shè)計(jì)了對照實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)組生物指示劑和待滅菌物品在121℃下滅菌15 min，對照組生物指示劑沒有進(jìn)行滅菌處理。然后，將實(shí)驗(yàn)組生物指示劑和對照組生物指示劑放在60℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)48 h 后，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組安瓿的內(nèi)容物呈紫紅色且澄清；對照組安瓿的內(nèi)容物呈橘黃色且渾濁。這證明蒸汽滅菌器的滅菌過程有效，可殺滅孢子菌。

《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（2010 年修訂）》中將驗(yàn)證定義為：證明任何操作規(guī)程（或方法)、生產(chǎn)工藝或系統(tǒng)能夠達(dá)到預(yù)期結(jié)果的一系列活動(dòng)［1］。并提到企業(yè)的廠房、設(shè)施、設(shè)備和檢驗(yàn)儀器應(yīng)當(dāng)經(jīng)過確認(rèn)，應(yīng)當(dāng)采用經(jīng)過驗(yàn)證的生產(chǎn)工藝、操作規(guī)程和檢驗(yàn)方法進(jìn)行生產(chǎn)、操作和檢驗(yàn)，并保持持續(xù)的驗(yàn)證狀態(tài)［1］。

《中華人民共和國藥典（2020年版 四部）》中將生物指示劑定義為：一種對特定滅菌程序有確定及穩(wěn)定耐受性的特殊活微生物制成品［2］。并提到濕熱滅菌121℃的生物指示劑通常選擇嗜熱脂肪地芽孢桿菌，且芽孢數(shù)范圍在1.0×105～5.0×106，D 值為1.5～3 min，存活時(shí)間在4.5～14 min，殺滅時(shí)間在13.5～32.0 min。

《中華人民共和國藥典（2020年版 四部）》中將濕熱滅菌法定義為：將物品置于滅菌設(shè)備內(nèi)利用飽和蒸汽、蒸汽-空氣混合物、蒸汽-空氣-水混合物、過熱水等手段使微生物菌體中的蛋白質(zhì)、核酸發(fā)生變性而殺滅微生物的方法［3］。

1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h2>

為了驗(yàn)證微生物檢驗(yàn)過程中所用物品經(jīng)滅菌后能否達(dá)到無菌狀態(tài)，本實(shí)驗(yàn)以公司化驗(yàn)室的蒸汽滅菌器能否殺滅孢子菌為判斷依據(jù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。首先，將生物指示劑和待滅菌物品一同置于蒸汽滅菌器中，在121℃下滅菌15 min。然后，把生物指示劑放在60℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。最后，如果安瓿的內(nèi)容物呈紫紅色且澄清，則證明公司蒸汽滅菌器的滅菌過程有效，可殺滅孢子菌；如果安瓿的內(nèi)容物呈橘黃色且渾濁，則證明公司蒸汽滅菌器的滅菌過程失效，不能殺滅孢子菌。滅菌過程失效會(huì)導(dǎo)致因檢驗(yàn)物品引入微生物，造成假陽性的風(fēng)險(xiǎn)。

2 實(shí)驗(yàn)原理

生物指示劑與要經(jīng)過高壓滅菌的待滅菌物品一起放入高壓滅菌器中［4］，在121±0.5℃（245 kPa）的壓縮蒸汽中加熱15 min 后，孢子完全被殺死。高壓滅菌后，通過安瓿的培養(yǎng)檢查滅菌過程是否成功：嗜熱脂肪土桿菌沒有生長表明滅菌充分，反之則表明滅菌不充分。

3 實(shí)驗(yàn)過程

3.1 實(shí)驗(yàn)材料

3.1.1 設(shè)備

本次實(shí)驗(yàn)所用到的設(shè)備為YXQ-LS-100G 立式壓力蒸汽滅菌器和BSP-150 生化培養(yǎng)箱。

3.1.2 物料

本次實(shí)驗(yàn)所用到的物料為生物指示劑Sterikon?plusBioindicator。

3.2 方法與結(jié)果

3.2.1 方法

3.2.1.1 流程

本次實(shí)驗(yàn)的思路為通過對生物指示劑進(jìn)行滅菌和培養(yǎng)，得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，從而得出實(shí)驗(yàn)結(jié)論。

3.2.1.2 過程

步驟1：將6 支生物指示劑用標(biāo)簽依次標(biāo)為1、2、3、4、5 和6，作為實(shí)驗(yàn)組；額外多準(zhǔn)備1 支生物指示劑作為對照組，一起拍照。

步驟2：將實(shí)驗(yàn)組6 支生物指示劑按照2 支一小組，放在燒杯中。打開滅菌器，將燒杯按照上、中、下三層和待滅菌物品放在滅菌器中，拍照，關(guān)閉滅菌器。

步驟3：設(shè)置滅菌器的滅菌溫度為121℃，滅菌時(shí)間為15 min，打開滅菌器電源進(jìn)行滅菌。

步驟4：待滅菌結(jié)束，將滅菌后的實(shí)驗(yàn)組和對照組生物指示劑拍照。

步驟5：將滅菌后的生物指示劑及時(shí)放置在培養(yǎng)箱，然后調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度為60℃，并培養(yǎng)48 h。隨后取出培養(yǎng)后的生物指示劑，觀察安瓿的內(nèi)容物，并與生物指示劑照片作比較。

重復(fù)步驟1 至步驟5，連續(xù)驗(yàn)證3 次。

3.2.2 合格標(biāo)準(zhǔn)

如果經(jīng)滅菌和培養(yǎng)后，安瓿的內(nèi)容物呈紫紅色且澄清，則證明公司化驗(yàn)室的蒸汽滅菌器的滅菌過程有效，可殺滅孢子菌；

如果經(jīng)滅菌和培養(yǎng)后，安瓿的內(nèi)容物呈橘黃色且渾濁，則證明公司化驗(yàn)室的蒸汽滅菌器的滅菌過程失效，不能殺滅孢子菌。

3.2.3 結(jié)果

連續(xù)驗(yàn)證3 次后，實(shí)驗(yàn)組安瓿的內(nèi)容物都呈紫紅色且澄清。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 生物指示劑驗(yàn)證結(jié)果統(tǒng)計(jì)

3.3 結(jié)論

根據(jù)表1 可得知，公司化驗(yàn)室的蒸汽滅菌器在121℃保持15 min 滅菌的條件下，能夠殺滅孢子菌?；?yàn)室在日常微生物檢驗(yàn)過程中，用121℃條件下滅菌15 min 的方式能徹底殺滅包括孢子菌在內(nèi)的所有微生物，而不會(huì)因?yàn)闅⒕粡氐祝蛭⑸餀z驗(yàn)用物品引入微生物，造成假陽性的風(fēng)險(xiǎn)。公司化驗(yàn)室的蒸汽滅菌器可滿足日常檢驗(yàn)時(shí)的滅菌使用要求。

3.4 注意事項(xiàng)

3.4.1 生物指示劑的運(yùn)輸和儲(chǔ)藏

生物指示劑在運(yùn)輸過程中，需保持其處于恒定的溫度。生物指示劑送達(dá)公司后，應(yīng)立即置于冰箱冷藏柜進(jìn)行冷藏；試驗(yàn)室取出生物指示劑后，應(yīng)盡快開始滅菌。當(dāng)生物指示劑儲(chǔ)存于冰箱中時(shí)（恒定溫度為2～8℃），應(yīng)保證其在包裝上打印的有效期之前保持穩(wěn)定。室溫條件下生物指示劑的儲(chǔ)存周期為1～2 周，儲(chǔ)存溫度超過30℃時(shí)會(huì)影響產(chǎn)品的穩(wěn)定性。

3.4.2 蒸汽滅菌器的確認(rèn)

開展蒸汽滅菌器滅菌效果的驗(yàn)證之前，應(yīng)對蒸汽滅菌器實(shí)施運(yùn)行確認(rèn)和性能確認(rèn)。運(yùn)行確認(rèn)是為了保證蒸汽滅菌器的運(yùn)行符合設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)；性能確認(rèn)是為了保證蒸汽滅菌器在正常操作方法和工藝條件下能夠持續(xù)符合標(biāo)準(zhǔn)。

3.4.3 生物指示劑的滅菌

容量不超過250 L 的蒸汽滅菌器應(yīng)至少使用2 支安瓿進(jìn)行檢查，而容量超過250 L 的高壓滅菌器應(yīng)至少使用6 支安瓿進(jìn)行檢查。（這里需要注意的是：在放入蒸汽滅菌器之前，需用力搖動(dòng)每支安瓿，以分散孢子。）

為了避免意外破損造成污染，建議將安瓿放在玻璃燒杯中，并將其放在高壓滅菌器的底部或中部（通常被認(rèn)為是最不利滅菌的位置）。滅菌后，取出安瓿，并在60±2℃下培養(yǎng)48 h。（這里需要注意的是：應(yīng)避免在超過125℃的滅菌溫度下使用安瓿，以防止損壞生物指示劑。）

3.4.4 生物指示劑的培養(yǎng)

首先需要對培養(yǎng)生物指示劑的培養(yǎng)箱實(shí)施運(yùn)行確認(rèn)和性能確認(rèn)。運(yùn)行確認(rèn)是為了證明培養(yǎng)箱的運(yùn)行符合設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)；性能確認(rèn)是為了證明培養(yǎng)箱在正常操作方法和工藝條件下能夠持續(xù)符合標(biāo)準(zhǔn)。將滅菌后的生物指示劑及時(shí)放置在培養(yǎng)箱中，然后調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度為60℃，并培養(yǎng)48 h。

3.4.5 蒸汽滅菌器滅菌效果的驗(yàn)證頻率

蒸汽滅菌器的滅菌效果驗(yàn)證至少一年開展1 次。

3.4.6 蒸汽滅菌器滅菌驗(yàn)證的文件要求

關(guān)于蒸汽滅菌器的滅菌效果驗(yàn)證，首先制定驗(yàn)證方案,并經(jīng)審核、批準(zhǔn)，同時(shí)驗(yàn)證方案應(yīng)當(dāng)明確職責(zé)。其次，驗(yàn)證應(yīng)當(dāng)按照預(yù)先確定和批準(zhǔn)的方案實(shí)施，并記錄。驗(yàn)證工作完成后,應(yīng)寫出報(bào)告,并經(jīng)審核、批準(zhǔn)。驗(yàn)證的結(jié)果和結(jié)論（包括評價(jià)和建議）應(yīng)記錄并存檔。最后，應(yīng)當(dāng)根據(jù)驗(yàn)證的結(jié)果確認(rèn)工藝規(guī)程和操作規(guī)程。

4 實(shí)驗(yàn)總結(jié)

根據(jù)《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（2010 年修訂）》、《中華人民共和國藥典（2020 年版 四部）》、《YXQLS-100G 立式壓力蒸汽滅菌器使用說明書》、《BSP-150 生化培養(yǎng)箱（液晶顯示）使用說明書》和《Sterikon?plus Bioindicator 使用說明書》制定了本次“蒸汽滅菌器滅菌效果驗(yàn)證方案”，經(jīng)審核、批準(zhǔn)后按照方案進(jìn)行驗(yàn)證。根據(jù)驗(yàn)證結(jié)果編寫了“蒸汽滅菌器滅菌效果驗(yàn)證報(bào)告”，并經(jīng)審核與批準(zhǔn)。蒸汽滅菌器驗(yàn)證結(jié)論為：實(shí)驗(yàn)組生物指示劑經(jīng)121℃滅菌15 min，60℃培養(yǎng)48 h 后，在安瓿的內(nèi)容物呈紫紅色且澄清；而對照組生物指示劑經(jīng)60℃培養(yǎng)48 h 后，在安瓿的內(nèi)容物呈橘黃色且渾濁。這證明公司化驗(yàn)室的蒸汽滅菌器在121℃、滅菌15 min 的設(shè)置下，能夠殺滅孢子菌。化驗(yàn)室在日常微生物檢驗(yàn)過程中，用在121℃條件下滅菌15 min 的方式，能徹底殺滅包括孢子菌在內(nèi)的所有微生物，而不會(huì)因?yàn)闅⒕粡氐?，因微生物檢驗(yàn)用物品引入微生物，造成假陽性的風(fēng)險(xiǎn)。公司化驗(yàn)室的蒸汽滅菌器可滿足日常檢驗(yàn)時(shí)的滅菌使用要求。