文/ Stefan Vossk?tter 博士

制藥行業(yè)必須對(duì)雜質(zhì)進(jìn)行鑒別、測(cè)定和歸類——由于HPLC 紫外檢測(cè)器中的濃度和條件相差很大，一次測(cè)量通常無法檢測(cè)完所有項(xiàng)目，因此需要進(jìn)行兩次測(cè)量：一次用于確定活性物質(zhì)，另一次用于檢測(cè)雜質(zhì)。本文將介紹一種僅需一次測(cè)量便可對(duì)藥物活性成分和雜質(zhì)完成鑒定的方法。

在不同的生產(chǎn)方式下生產(chǎn)同種藥物活性成分，會(huì)產(chǎn)生不同規(guī)模和類型的雜質(zhì)。在某些情況下，這些污染物會(huì)使藥物喪失其原本的治療效果，甚至引發(fā)致癌風(fēng)險(xiǎn)或?qū)θ梭w造成嚴(yán)重?fù)p害。

放眼全球新聞，會(huì)不時(shí)看到報(bào)道這樣的案例，制藥生產(chǎn)廠搬遷后出現(xiàn)污染，有人因其產(chǎn)生的副作用而患上并發(fā)癥甚至出現(xiàn)人員死亡的情況。由此可以看出，現(xiàn)有配方的質(zhì)量控制固然十分重要，但也不能忽略新制劑的開發(fā)階段。這一階段必須對(duì)污染物進(jìn)行歸類和測(cè)定，在篩選潛在活性物質(zhì)時(shí)就需要檢測(cè)其副產(chǎn)物并對(duì)目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行分離。

在所有的工作流程中，分析操作占據(jù)了很大一部分時(shí)間，這是一個(gè)不容忽視的因素。如果能夠?qū)⒎治鏊俣燃涌?，便可以檢測(cè)出更多的潛在活性成分，更快地開發(fā)出新制劑以及加快生產(chǎn)過程。下面將介紹一些新的解決方案和方法。

通過HPLC 和UV 檢測(cè)污染物

人們通常采用HPLC 方法測(cè)量雜質(zhì)和活性物質(zhì)，但測(cè)出的濃度差異很大，如表1 所示。歐洲藥品管理局的ICH 指南為新藥的報(bào)告、鑒定和定性設(shè)立了各種極限值。以攝入量為例，如果每天的攝入量不超過2 g，那么其極限值為0.10%；如果每天的攝入量超過了2 g，則極限值為0.05%[1]。這一測(cè)量過程通常需要采用不同的方法分別對(duì)污染物和藥物進(jìn)行測(cè)定。

借助Shimadzu 的新型光電二極管陣列檢測(cè)器SPD-M40，藥物活性成分和雜質(zhì)的測(cè)定變得更加容易。新設(shè)計(jì)完全消除了雜散光，擴(kuò)展了線性范圍，提高了靈敏度并降低了信噪比。

使用酮洛芬制劑檢驗(yàn)線性度：制備0.5～800 mg/l 的標(biāo)準(zhǔn)溶液并進(jìn)行測(cè)量，分析條件如表2 所示。圖1 是將各種測(cè)量值疊加在一起，圖2 中的面積與濃度對(duì)應(yīng)，形成校準(zhǔn)線。盡管校準(zhǔn)范圍很廣，但決定系數(shù)R2也達(dá)到了0.9998。

圖1 0.5～800 mg/l 范圍內(nèi)的酮洛芬校準(zhǔn)的色譜圖

圖2 R2值為0.9998 的酮洛芬校準(zhǔn)的校準(zhǔn)度

當(dāng)制備700 mg/l 的酮洛芬標(biāo)準(zhǔn)液時(shí)，更容易看出其在測(cè)定雜質(zhì)時(shí)的優(yōu)勢(shì)（如圖3 所示）。即使污染小于主峰面積的0.1%，也可以輕松鑒別，并且得到的標(biāo)準(zhǔn)偏差依然很小。濃度為0.126%的雜質(zhì)1 是唯一需要鑒別的，其標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.598% RSD。

圖3 酮洛芬700 mg/l 標(biāo)準(zhǔn)液的重疊色譜圖

無需第二次測(cè)量

由于雜質(zhì)和主要活性成分可以在色譜圖中確定，因此無需進(jìn)行第二次測(cè)量。這樣可節(jié)省約一半的時(shí)間。如果校準(zhǔn)濃度范圍未達(dá)標(biāo)準(zhǔn)，可以使用LabSolutions LC 的功能軟件i-DReC 對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)展。

如果光譜中的峰易于辨別，則只有UV 光譜的強(qiáng)度會(huì)隨注入濃度發(fā)生變化，而不會(huì)隨過程發(fā)生變化。在正常情況下，為了提高檢測(cè)限，會(huì)對(duì)吸光度最高的波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)。如果檢測(cè)器進(jìn)入飽和區(qū)域，則可以看到校準(zhǔn)曲線呈逐漸變平之勢(shì)。從這點(diǎn)之后，便會(huì)脫離圖4 中通過實(shí)例展示的非線性區(qū)域（藍(lán)色區(qū)域）。

表1：ICH 指南中描述的新藥物極限值[1] (圖片:Shimadzu)

表2：HPLC 測(cè)量的分析參數(shù)(圖片:Shimadzu)

借助i-DReC 功能，會(huì)自動(dòng)將目標(biāo)化合物的第二大UV 光譜峰作為目標(biāo)，其強(qiáng)度較低，檢測(cè)器不再處于飽和狀態(tài)，而是處于線性范圍內(nèi)。由于過程沒有發(fā)生變化，因此兩個(gè)點(diǎn)的強(qiáng)度之比也便一目了然。該系數(shù)可以在兩個(gè)所用波長(zhǎng)之間進(jìn)行換算，同時(shí)校準(zhǔn)線可以擴(kuò)展到更高的濃度范圍。

改善后的雜質(zhì)檢出限

操作結(jié)果如圖4 所示，校準(zhǔn)線直到高濃度下都呈線性相關(guān)，系數(shù)R 為0.9996726。如果將其用于典型的活性藥物成分（如圖5所示），注入濃度還可以高出更多。故可以明顯地提高雜質(zhì)的檢測(cè)極限。表4 總結(jié)了這一測(cè)量的結(jié)果：雜質(zhì)小于主峰的0.5%時(shí)仍能很好地進(jìn)行測(cè)量，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差%RSD <0.9。

圖4 使用和不使用i-DreC 的校準(zhǔn)

圖5 含雜質(zhì)的活性成分的色譜圖

經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)兩種物質(zhì)沒有基線分離但卻需要定量的情況，如果色譜圖非常復(fù)雜，換來的可能只是時(shí)間的浪費(fèi)，因?yàn)榈貌坏较胍慕Y(jié)果。借助功能軟件i-PDeA構(gòu)建的數(shù)學(xué)模型，可以分離出兩種共洗脫物質(zhì)。但也有一個(gè)前提，它們的UV 光譜必須不同，為此，人們需要借助單個(gè)物質(zhì)的不同UV光譜。圖6 通過測(cè)量二氟二苯甲酮（DFBP）和乙烯基吡咯烷酮（VP）進(jìn)行了實(shí)例展示，由結(jié)果可知，兩個(gè)獨(dú)立的檢測(cè)器通道具有各自分離的峰。也就是說，可以借助功能軟件i-PDeA 對(duì)其進(jìn)行定量分析。

圖6 使用i-PdeA 對(duì)兩個(gè)共洗脫峰進(jìn)行數(shù)學(xué)分離

表4：借助i-DreC 的分析結(jié)果(圖片:Shimadzu)

新的應(yīng)用領(lǐng)域

這些特性的結(jié)合在具有紫外線檢測(cè)功能的HPLC 中開創(chuàng)了新的應(yīng)用領(lǐng)域，樣品的測(cè)量次數(shù)至此也縮減到了一次。由于SPD-M40 檢測(cè)器與軟件功能由經(jīng)過驗(yàn)證的、滿足規(guī)范環(huán)境（如21 CFR Part 11）和數(shù)據(jù)完整性要求的軟件進(jìn)行控制，因此這些功能也滿足法規(guī)的相關(guān)要求。

總結(jié)

新的技術(shù)和功能為優(yōu)化現(xiàn)有流程和節(jié)省資源提供了巨大潛力，憑借其擴(kuò)展的線性度、很低的信噪比和全新的軟件功能（如LabSolution LC 的i-DReC），用戶僅需一次測(cè)量便能確定雜質(zhì)和活性物質(zhì)。除了節(jié)省時(shí)間的優(yōu)勢(shì)外，還提供了另一個(gè)可能性，即可將污染結(jié)果與所測(cè)樣品進(jìn)行比對(duì)。其他功能（如峰純度）可用于確定峰的光譜純度，從而排除所有吸收紫外線雜質(zhì)的干擾。由于控制軟件符合21 CFR Part 11 的要求，因此在監(jiān)管嚴(yán)格的領(lǐng)域中也可使用這些功能。