李 靜，焦向陽，白廣紅，仵倩紅

(陜西省結(jié)核病防治院檢驗科，陜西 西安 710100)

結(jié)核性腦膜炎(tuberculousmeningitis，TBM)是臨床上一種常見的肺外結(jié)核，被認為是最嚴重的肺外結(jié)核(EPTB)，約占EPTB病例中的5%～10%[1]，死亡率高達67.2%[2]，該病多發(fā)于青壯年，發(fā)病無明顯季節(jié)性[3-4]且發(fā)病隱匿，常繼發(fā)于其他系統(tǒng)的感染，大多為結(jié)核分枝桿菌經(jīng)血循環(huán)進入顱內(nèi)而發(fā)病。臨床表現(xiàn)缺乏特異性，病原學陽性檢出率很低[5]，所以早期診斷極為困難。早期快速的實驗室診斷方法能夠為患者的治療和預(yù)后提供較大幫助。由于條件限制，對于基層而言，實驗室診斷TBM常用的檢測方法是：抗酸桿菌(AFB)涂片和分枝桿菌培養(yǎng)。AFB涂片雖然快速、價低，但是腦脊液標本陽性檢出率及敏感性都很低，而分枝桿菌培養(yǎng)周期長、不能滿足臨床早期、快速診治的需求，故尋求一種新的快速、準確且高敏感度和高特異度的實驗室診斷方法成為TBM檢測工作的重要目標。GeneXpert是以全自動半巢式實時PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，以rpoB基因為靶基因，在2 h內(nèi)同時快速檢測結(jié)核分枝桿菌和利福平(rifampin,RIF)耐藥。2013年GeneXpert檢測作為新型分子診斷技術(shù)被WHO推薦用于肺外結(jié)核的診斷[6-7]。但目前GeneXpert用于腦脊液樣本的診斷價值說法不一，本研究中，通過對比分析AFB涂片、MGIT960培養(yǎng)、GeneXpert檢測對TBM的診斷效能，進一步評估GeneXpert檢測對TBM的診斷價值。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

收集2019年1月至2020年6月陜西省結(jié)核病防治院收治的同時采用AFB涂片、MGIT960培養(yǎng)和GeneXpert檢測的142例疑似TBM患者，其中確診TBM組中男52例(63.4%)、女30例(36.6%)；年齡12～76歲，中位年齡為32(25,47)；非TBM組中男33例(55.0%)、女27例(45.0%)，年齡14～81歲，中位年齡為30(25,56)。所有患者臨床確診資料均來源于臨床原始病例記錄，且通過本院倫理委員會審核，獲得所有患者知情同意。

1.2 診斷依據(jù)

參照2010年國際TBM協(xié)作組[8]制定的評分標準，按此標準，臨床診斷為TBM患者共82例(包括確診的TBM 46例，很可能的TBM 26例，可能的TBM 10例)；非TBM組60例患者(包括臨床評分<6分的疑似結(jié)核性腦膜炎患者38例，化膿性腦膜炎15例，病毒性腦膜炎7例)。

1.3 主要試劑和儀器

抗酸染色試劑為實驗室自配萋尼染色試劑；MGIT960檢測系統(tǒng)所用的培養(yǎng)儀及試劑均由美國BD公司提供；GeneXpert檢測系統(tǒng)及配套試劑盒均購于美國Cepheid公司。

1.4 實驗室檢測方法

按照無菌采集標本的要求收集留取腦脊液≥5 mL，每份標本均進行AFB涂片、MGIT960培養(yǎng)和GeneXpert檢測。

1.4.1 AFB涂片 嚴格按照《結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程》[9]操作。將腦脊液標本用一次性吸管吸取少許于潔凈玻片上涂片，大小約為1 cm×2 cm、干燥后萋尼染色鏡檢，按照檢驗規(guī)程報告結(jié)果。

1.4.2 MGIT960培養(yǎng) 嚴格按照《結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程》[9]操作。取0.5 mL腦脊液標本接種至MGIT960培養(yǎng)管中，加入0.8 mL營養(yǎng)添加劑(OADC)和雜菌抑制劑(PANTA)的混合液，嚴格按照說明進行操作。將接種好的MGIT960培養(yǎng)管放入MGIT960系統(tǒng)中孵育，儀器對分枝桿菌的生長進行自動監(jiān)測。儀器報陽后采用結(jié)核分枝桿菌抗原檢測試劑盒(MPB64)進行結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌的初步鑒定[10]。

1.4.3 GeneXpert 嚴格按照操作說明書進行檢驗。將1 mL腦脊液標本與2 mL GeneXpert系統(tǒng)前處理液混合，擰緊瓶蓋，渦旋振蕩15 s，室溫靜置15 min，使標本充分液化，將消化后的2 mL樣品用無菌吸管吸入GeneXpert系統(tǒng)測試盒中，上機檢測，約2 h報告結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。以臨床確診患者為參考標準，評價AFB涂片、MGIT960培養(yǎng)、GeneXpert技術(shù)的敏感度、特異度、符合率、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值。組間率的比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同檢測方法對TBM的陽性檢出率

回顧性分析臨床確診142例的住院患者，其中臨床確診為結(jié)核性腦膜炎有(TBM組)82例(82/142,57.7%),其中AFB涂片檢出陽性3例，陰性79例，陽性檢出率為3.7%(3/82)；MGIT960培養(yǎng)檢出陽性20例，陰性62例，陽性檢出率為24.4%(20/82)；Xpert分子檢出陽性33例，陰性49例，陽性檢出率為40.2%(33/82)。

2.2 不同檢測方法診斷TBM的檢測效能

以臨床確診患者為標準，AFB涂片、MGIT960培養(yǎng)、GeneXpert對TBM的檢測效能見表1。腦脊液標本AFB涂片的敏感度低于MGIT960培養(yǎng)(χ2=14.615，P<0.05)，GeneXpert檢測的敏感度高于AFB涂片的敏感度(χ2=32.031，P<0.05)和MGIT960培養(yǎng)(χ2=4.711，P<0.05)。

表1 不同檢測方法對TBM診斷效能分析

3 討論

TBM是神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核病最常見的類型，由結(jié)核分枝桿菌侵入蛛網(wǎng)膜下隙引起軟腦膜、蛛網(wǎng)膜病變進而累及腦血管，部分可累及腦實質(zhì)，在我國為常見病，致殘率及死亡率高[11]。由于TBM早期臨床癥狀不明顯和缺乏特異性常常導(dǎo)致診斷的延誤，從而影響患者的生存質(zhì)量并危及生命。傳統(tǒng)的細菌學檢測方法仍是結(jié)核病診斷的“金標準”，然而與痰標本不同，腦脊液標本實驗室檢查中AFB涂片查找抗酸桿菌的陽性率很低，而分枝桿菌培養(yǎng)周期長、不能滿足臨床早期、快速、準確診治的需求，故尋求一種新的快速、準確且高敏感度和高特異度的診斷方法成為TBM檢測工作的重要目標。而GeneXpert作為新型分子診斷技術(shù)，其在肺外結(jié)核中的診斷價值已被多項研究評估[12-14]，認為應(yīng)用GeneXpert檢測胸腔積液、骨關(guān)節(jié)結(jié)核部位膿液標本具有較高的敏感度和檢測方法的優(yōu)越性，被認為可用于肺外結(jié)核的各種類型的臨床標本檢測的確證性診斷試驗，但對于腦脊液的診斷敏感度還存在爭議[15-17]，需要進行更深入的研究[18]。2019年鄭立恒，等[19]以臨床診斷為診斷標準比較了AFB涂片和GeneXpert檢測方法在TBM中的診斷敏感度，分別為4.44%(2/45)和35.56%(16/45)。鄭會強，等[20]以臨床診斷為標準比較了MGIT960培養(yǎng)和GeneXpert檢測方法在TBM中的診斷敏感度，分別為19.7%(14/71)和42.3%(30/71)。本研究中以臨床確診為診斷標準比較了AFB涂片、MGIT960培養(yǎng)和GeneXpert3種檢測方法在TBM中的診斷敏感度，分別為3.7%(3/82；95%CI：0.4%～7.7%)，24.4%(20/82；95%CI：15.1%～33.7%)和40.2%(33/82；95%CI：29.6%～50.9%)。相比于上面提到的研究，本研究中AFB涂片敏感度較低，分析原因主要有以下2點：①腦脊液標本含菌量本就較低，而由于腦脊液所處位置特殊，每次所留取樣本量較少，含菌量更少，使得AFB涂片陽性檢出率更低；②本研究中AFB涂片法的腦脊液標本染色具體實驗操作方法同痰液，冷染0.5 h，而腦脊液標本相比痰液黏附率本身就很低[21]，冷染時間長，固定效果減弱沖片時更容易脫落，且AFB涂片需抗酸桿菌達到5×103～1×104個/mL的濃度才能檢測出陽性結(jié)果，涂片樣本量難以達到檢測需求故而陽性檢出率更低。MGIT960培養(yǎng)的敏感度較高的可能原因為：①本研究入選TBM患者選擇嚴格；②MGIT960培養(yǎng)對環(huán)境要求極高，操作較為復(fù)雜，但所有操作人員均受到嚴格的訓(xùn)練，操作規(guī)范。

本研究中，GeneXpert檢測的敏感度明顯高于其他兩種檢測方法，其中MGIT960培養(yǎng)和GeneXpert的檢測陽性者僅有10例為同時陽性，重疊比例較低，這可能的原因為：本研究中大多TBM患者在留取樣本之前已服用抗結(jié)核藥物治療，而結(jié)核菌培養(yǎng)主要檢測的是活的結(jié)核分枝桿菌，GeneXpert主要檢測的是結(jié)核分枝桿菌的DNA，抗結(jié)核藥物會影響結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)陽性檢出率，且MGIT960培養(yǎng)與GeneXpert的細菌濃度陽性閾值檢測限也不同(前者為10～100條/mL，后者為131條/mL)。在這3種檢測方法中GeneXpert檢測有明顯的優(yōu)點：操作簡便、快速、2 h可在患者標本中直接檢測結(jié)核分枝桿菌，敏感度高，對TBM的早期診斷、治療和預(yù)后有很大的幫助，且能檢測利福平是否耐藥。

本研究也存在一定的局限性，①雖然統(tǒng)計了一年半的疑似病例，但最終納入的TBM患者樣本量仍然很少；②由于實驗室檢測條件有限，無法對不相符的檢測結(jié)果進行深入研究。

綜上所述，AFB涂片檢測TBM的陽性率極低，MGIT960培養(yǎng)周期較長，不適于TBM的早期診斷。GeneXpert檢測的敏感度明顯高于傳統(tǒng)的AFB涂片和結(jié)核菌培養(yǎng)，且生物安全風險性極低，對TBM早期診斷具有良好的指導(dǎo)意義。在臨床工作中優(yōu)先選擇GeneXpert檢測用于診斷，幫助TBM患者早期診斷，減少漏診及誤診，降低死亡率。