趙儷月，巴曉曄，王寶彥

(1．廣州市第一人民醫(yī)院口腔科，廣東 廣州 510180；2.西安高新醫(yī)院口腔科，陜西 西安 710075；3.西安交通大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周黏膜科，陜西 西安 710004)

牙周炎作為一種慢性感染性疾病，是天然牙喪失的重要原因。治療的難點是如何使已被破壞的牙周組織得到再生。牙周再生有兩項基本要素，包括病損區(qū)存在未分化的干細胞[1]，以及它們需要首先黏附于病損區(qū)的牙根表面[2-3]。牙周膜干細胞(Periodontal ligament stem cells,PDLSCs)和骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)是兩種具有牙周再生能力的干細胞[4-7]，常在牙周組織需要修復(fù)時遷移到受損區(qū)幫助修復(fù)[4，6]。它們通常會表達多種整合素，后者在細胞的黏附行為中起到關(guān)鍵作用[3、8]，在整合素家族中，α5β1可能與PDSLCs和BMMSCs的黏附過程最為相關(guān)[9-10]。苯妥英鈉(Phenytoin,PHT)已被證實具有促進rPDLSCs遷移到牙周缺損區(qū)及黏附于牙根表面的功能[11-12]，但具體的機制尚不清楚。本項研究的目的旨在觀察并對比PHT對rBMMSCs和rPDSLCs黏附于牙骨質(zhì)的影響，并探究整合素α5β1在該過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 rBMMSCs、rPDLSCs的分離及鑒定

1.1.1 rBMMSCs的原代培養(yǎng) 脫頸法處死6周齡SD大鼠，取股骨，用含20%FBS(Hyclone，美國)的DMEM-F12培養(yǎng)液(Hyclone，美國)反復(fù)沖洗骨髓腔。密度梯度離心法獲得rBMMSCs。有限稀釋法純化細胞。

1.1.2 rPDLSCs原代培養(yǎng) 脫頸法處死6周齡SD大鼠；分離上下頜切牙，刮取根中1/3的牙周膜，采用常規(guī)酶消化法+組織塊法獲取rPDLSCs。有限稀釋法純化細胞。

1.1.3 rBMMSCs、rPDLSCs的鑒定 鑒定rBMMSCs、rPDLSCs的方法如下：①形態(tài)學(xué)觀察、生長特性觀察；②成骨、成脂誘導(dǎo)分化；③流式細胞術(shù)分析細胞表面標(biāo)記物。

1.2 黏附實驗

1.2.1 實驗分組 將每個制好的相同大小牙骨質(zhì)片置于96孔板內(nèi)1孔內(nèi)，使rBMMSCs、rPDLSCs分別與牙骨質(zhì)片共同培養(yǎng)，并各分為4個處理組，A組：PBS(沃爾森，中國)處理，作為空白對照；B組：40 mg/L PHT(沃爾森，中國)處理；C組：40 mg/L PHT+整合素α5抗體(Millipore，美國)處理，D組：40 mg/L PHT+整合素β1抗體(Abcam，英國)處理，每組設(shè)6個重復(fù)孔。細胞密度為105個/mL，37℃、5%CO2條件下處理4 h。

1.2.2 黏附細胞計數(shù) 處理結(jié)束后，用DMEM-F12培養(yǎng)基沖洗牙骨質(zhì)片兩遍，再將它們放入新鮮的DMEM-F12培養(yǎng)基中，在旋轉(zhuǎn)振蕩儀上振蕩3 min(75 rpm)，以去除未黏附的或黏附力較弱的細胞。處理后的牙骨質(zhì)片放于新的96孔板中，每孔加入100 μL DMEM-F12培養(yǎng)基和10 μL WST-8溶液(碧云天，中國)，37℃、5%CO2條件下孵育2 h。之后將96孔板放入酶標(biāo)儀，在450 nm波長條件下檢測吸光度。用Image-ProPlus軟件算得各牙骨質(zhì)片的面積，算出16 mm2面積牙骨質(zhì)片上的細胞的OD值。

1.3 PHT對rBMMSCs、rPDLSCs表達整合素α5、β1的影響

1.3.1 實時定量PCR測定細胞整合素α5β1的表達從GenBank(Pubmed)選取靶基因mRNA的全長序列，使用引物和探針設(shè)計軟件Primer Express設(shè)計引物序列如下(見表1)，所用引物序列乃由上海生工公司合成。

表1 引物序列

rBMMSCs、rPDLSCs分別在使用不含PHT、含PHT(40 mg/L)的DMEM-F12培養(yǎng)液(10%FBS，1%雙抗)培養(yǎng)4 h后，收集細胞，提取RNA，經(jīng)過濃度及純度測定后，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，日本)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行PCR擴增。qRT-PCR反應(yīng)體系如下：cDNA溶液2 μL、上下游引物(10μM)各1 μL、dH2O 8.5 μL、SYBRPremixExTaqII(2×)12.5 μl，所用PCR試劑盒購于日本Takara。

具體反應(yīng)條件：95℃30 s，1個循環(huán)；95℃5 s，60℃30 s，40個循環(huán)；95℃15 s，60℃30 s，95℃15 s，1個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，根據(jù)2-△△Ct算法，求出目的基因的相對表達量。

1.3.2 Western blot檢測細胞整合素α5β1的表達rBMMSCs、rPDLSCs在使用不含PHT、含PHT(40 mg/L)的DMEM-F12培養(yǎng)液(10%血清，1%雙抗)中各培養(yǎng)4 h后，收集細胞。用蛋白裂解液(沃爾森，中國)提取總蛋白，PAGE-SDS電泳分離蛋白，然后把蛋白凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，行轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，放封閉液后，分別加入一抗【兔抗大鼠integrinα5單克隆抗體(Millipore，美國)、兔抗大鼠integrin-β1單克隆抗體(Abcam，英國)】，4℃振蕩過夜。清洗后加入二抗，室溫下孵育2 h，用凝膠成像儀對蛋白表達結(jié)果進行分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 rBMMSCs、rPDLSCs的鑒定

2.1.1 rBMMSCs、rPDLSCs的形態(tài)觀察 rBMMSCs剛接種時為懸浮的圓形細胞。2 d換液后可見貼壁細胞，呈現(xiàn)出少量分散的梭性或不規(guī)則多突起的初始貼壁細胞。培養(yǎng)至第6～7 d，可見有細胞克隆形成，細胞由克隆中心向外擴散生長，并相互融合。細胞貼壁牢固，不易消化。篩選并傳代以后的細胞漸向多角形細胞轉(zhuǎn)化，不呈克隆樣生長，為均勻分布于培養(yǎng)皿底部的生長狀態(tài)(見圖1A)。

圖1 rBMMSCs和rPDLSCs(×100)

原代rPDLSCs細胞克隆形成平均在第7～14天，克隆內(nèi)的細胞呈梭型、緊密相鄰，中央細胞邊界不清，形態(tài)為不規(guī)則或圓形，周邊細胞為梭型、多角形。傳代后細胞貼壁快、生長旺盛而均勻，呈長梭形，類似成纖維樣細胞(見圖1B)。

2.1.2 rBMMSCs、rPDLSCs體外誘導(dǎo)分化 ①成骨誘導(dǎo) rBMMSCs、rPDLSCs在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)8 d后體積增大、生長旺盛，12 d左右細胞形態(tài)逐漸變?yōu)轭愃品叫位蚨嘟切巍?1 d后可見礦化結(jié)節(jié)產(chǎn)生，茜素紅染色陽性，對照組染色陰性(見圖2-1、圖2-2)。②成脂誘導(dǎo) rBMMSCs、rPDLSCs成脂誘導(dǎo)5 d后，可見部分細胞變?yōu)槎嘟切?，?0天鏡下觀察見細胞體積增大，油紅O染色見細胞內(nèi)出現(xiàn)染色陽性的脂滴，對照組未見胞內(nèi)有陽性染色的脂滴(見圖3-1、圖3-2)。成脂、成骨誘導(dǎo)結(jié)果說明本實驗分離的細胞具有干細胞多向誘導(dǎo)分化潛能。

圖2-1 rBMMSC的成骨誘導(dǎo)茜素紅染色(×100)

圖2-2 rPDLSCs的成骨誘導(dǎo)茜素紅染色(×100)

圖3-1 rBMMSC的成脂誘導(dǎo)油紅O染色(×200)

圖3-2 rPDLSCs的成脂誘導(dǎo)油紅O染色(×200)

2.1.3 流式細胞儀檢測rBMMSCs、rPDLSCs的表型流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示rBMMSCs細胞表面分子CD90、CD44陽性表達率分別為96.3%和97.1%，CD45、CD34陽性表達率分別是1.9%和8.4%(見圖4-1)，rPDLSCs細胞表面分子CD29陽性表達率為97.8%、CD44陽性表達率為94.1%，CD45、CD34則分別為1.2%和9.3%(見圖4-2)。均符合rBMMSCs、rPDLSCs表面特異性標(biāo)志物特征。

圖4-1 流式細胞儀鑒定rBMMSC表面標(biāo)記物

圖4-2 流式細胞儀鑒定rPDLSCs表面標(biāo)記物

2.2 PHT對rBMMSCs、rPDLSCs黏附的影響與整合素α5β1的關(guān)系

經(jīng)過PHT處理后，黏附于牙骨質(zhì)片的rBMMSCs、rPDLSCs細胞數(shù)量多于對照組，但在干預(yù)過程中加入整合素α5或整合素β1抗體(C、D組)，均使黏附于牙骨質(zhì)片上的細胞數(shù)目減少，且C、D組的黏附細胞數(shù)量少于對照組(P<0.05)。各實驗組內(nèi)，將rBMMSCs與rPDLSCs的黏附數(shù)目對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見圖5)。

圖5 整合素α5、β1抗體對PHT促進rBMMSCs、rPDLSCs黏附作用的影響

2.3 實時定量PCR檢測PHT對rBMMSCs、rPDLSCs的整合素α5、β1表達的影響

與對照組相比，PHT處理后的rBMMSCs、rPDLSCs的整合素α5、整合素β1的基因表達量顯著升高(P<0.01)。另外，無論在實驗組還是對照組，將rBMMSCs與rPDLSCs的整合素α5、整合素β1mRNA表達量相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(見圖6)。

圖6 PHT對rBMMSCs、rPDLSCs表達整合素α5、β1mRNA的影響

2.4 Western blot檢測PHT對rBMMSCs、rPDLSCs的整合素α5、β1表達的影響

與對照組相比，PHT處理后，rBMMSCs、rPDLSCs中整合素α5、整合素β1表達均增加(P<0.05)。在實驗組內(nèi)和對照組內(nèi)，將rBMMSCs與rPDLSCs的整合素α5、整合素β1蛋白表達量相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見圖7)。

圖7 PHT對rBMMSCs、rPDLSCs表達整合素α5、β1蛋白的影響

注：*：與對照組相比，P<0.05

3 討論

牙周組織再生的基礎(chǔ)是缺損區(qū)必須存在具有分化潛能的干細胞[1]。PDLSCs、BMMSCs具有間充質(zhì)干細胞的特性，能夠在組織受損后遷移到病損區(qū)，且在合適的理化條件下分化為成骨細胞、成牙骨質(zhì)細胞、成纖維細胞從而形成牙周軟硬組織，是重要的牙周再生的細胞來源。將它們植入牙周缺損中，可以減少探診出血、增加臨床附著水平和修復(fù)牙槽骨缺損[4-6，13]。因此，上述兩種細胞均為有牙周再生潛能的干細胞。在組織工程學(xué)中，將干細胞移植到目標(biāo)區(qū)域或器官時，移植細胞的黏附效率會影響再生效果[7]。同時，牙周組織破壞后能否形成理想的愈合形式，也取決于破壞區(qū)的根面會被什么細胞優(yōu)先黏附及占據(jù)[2]。所以，為了發(fā)揮PDLSCs和BMMSCs重要的牙周再生作用，關(guān)鍵是研究如何使它們加速黏附到根面上。

目前，關(guān)于干細胞黏附的促進劑，研究較多的對象為生長因子[14-16]。生長因子可以調(diào)節(jié)細胞的多種行為，包括促進細胞遷移和黏附等[15-16]。但有學(xué)者指出，將其直接應(yīng)用于機體時，存在代謝清除快、牙周再生效果有限且不可預(yù)測、使用成本較高等缺點[6]。

本研究選擇了PHT作為干細胞黏附、牙周再生的促進劑，具有價格低廉、性能穩(wěn)定等優(yōu)點。在課題組前期的研究中，已經(jīng)證實PHT可以促進rPDLSCs黏附于牙骨質(zhì)片，在PHT濃度低于40 mg/L時，促進作用隨濃度增高逐漸增強，但在40～100 mg/L濃度范圍時，該作用與藥物濃度呈負相關(guān)[12]。因此，在本實驗中筆者選擇的PHT濃度為40 mg/L，結(jié)果提示該濃度的PHT同樣可以提高rBMMSCs在牙骨質(zhì)片上的黏附數(shù)目。證明合適濃度的PHT能夠促進rBMMSCs、rPDLSCs黏附于牙根面上。

整合素是一種介導(dǎo)細胞黏附的跨膜蛋白，它在牙周組織愈合過程中起重要作用。動物研究證實，整合素α5β1參與調(diào)節(jié)成骨細胞黏附到種植體-骨界面并成骨的過程[17]。Ivanovski，等[9]研究結(jié)果顯示，整合素α5β1可以介導(dǎo)牙齦和牙周膜來源的成纖維細胞黏附在牙骨質(zhì)上。由此，本課題組認(rèn)為：PHT促進rBMMSCs、rPDLSCs黏附的作用可能與整合素α5β1的表達相關(guān)。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PHT對rBMMSCs、rPDLSCs黏附的增強作用在加入整合素α5、β1亞基抗體后，被明顯減抑制。說明整合素α5β1在rBMMSCs、rPDLSCs黏附于牙根面的過程中起到關(guān)鍵作用。PHT增強rBMMSCs、rPDLSCs黏附的作用也與整合素α5β1的表達密切相關(guān)。

在后續(xù)試驗中，通過實時定量PCR和Western-blot方法對PHT處理前后的rBMMSCs、rPDLSCs進行分析，檢測了兩種細胞整合素α5β1的表達水平。實驗結(jié)果表明，無論從mRNA水平還是蛋白水平，實驗組rBMMSCs、rPDLSCs表達整合素α5、β1水平均高于空白對照組。這進一步解釋了黏附實驗的結(jié)果：rBMMSCs、rPDLSCs均表達整合素α5β1，PHT促進rBMMSCs、rPDLSCs黏附于牙骨質(zhì)的作用與它上調(diào)了整合素α5β1的表達有關(guān)。

這個結(jié)果提示，PHT可以幫助有牙周再生潛能的rBMMSCs、rPDLSCs盡早黏附在牙根面，為形成與天然牙更相似的牙周組織帶來可能。另外，PHT增加rBMMSCs的黏附數(shù)量與增加rPDLSCs黏附的數(shù)量相比，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。同時，PHT促進上述兩種細胞間的整合素α5β1表達量相比，差異也沒有統(tǒng)計學(xué)意義。說明PHT對rBMMSCs、rPDLSCs的促黏附作用是相似的。由于PDLCSs僅來源于牙周膜，其數(shù)量相對較少，本研究結(jié)果提示，牙周治療中，也許可以用BMMSCs補充或替代PDLSCs的可能性。

綜上所述，本研究的結(jié)果表明整合素α5β1在rBMMSCs、rPDLSCs黏附于牙骨質(zhì)的過程中起著重要作用，40 mg/L PHT促進rBMMSCs、rPDLSCs黏附于牙骨質(zhì)片的作用與整合素α5β1的表達上調(diào)密切相關(guān)。然而PHT是通過什么信號通路與整合素α5β1發(fā)生作用，其中的發(fā)生機制如何仍然未知，還需要做進一步研究。