吳 博，趙菊梅，杜 娟，劉 楠

(1.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，陜西 延安 716000；2.延安市中醫(yī)醫(yī)院脾胃肝病科，陜西 延安 716000)

乳腺癌(Breast Cancer)是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，全世界每年約有120 萬(wàn)婦女患乳腺癌。我國(guó)目前雖不屬高發(fā)國(guó)家，但乳腺癌發(fā)病率上升較快，在許多大城市，其發(fā)病率已經(jīng)占據(jù)女性惡性腫瘤的首位。乳腺癌細(xì)胞之間疏散、易脫落，游離的癌細(xì)胞隨血液或淋巴液播散到全身，形成轉(zhuǎn)移，極大損害女性健康及至危及性命[1]。目前針對(duì)乳腺癌的主要治療手段為：手術(shù)治療同時(shí)輔助化療、內(nèi)分泌治療、靶向治療。其中，化療在乳腺癌的綜合治療中占據(jù)重要地位，對(duì)延緩或避免腫瘤復(fù)發(fā)、延長(zhǎng)患者生存期起著重要作用，但同時(shí)乳腺癌患者對(duì)化療藥物的耐藥現(xiàn)象普遍存在。鹽霉素(Salinomycin，以下簡(jiǎn)稱Sal)，是羧基載體類鉀離子載體抗生素，一種新型的抗腫瘤藥物,其來(lái)源于白色鏈霉菌(菌株號(hào)：No.80614)發(fā)酵液。多名研究者用Sal與多種癌細(xì)胞及癌干細(xì)胞進(jìn)行研究[2-4]，結(jié)果均表明Sal能夠抑制多種癌細(xì)胞及癌干細(xì)胞的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移，并誘導(dǎo)其凋亡。17-烯丙胺基-17-去甲氧基格爾德霉素(17-allyl-amino-17-demethoxygeldanamycin，17-AAG) 是在Hsp-90抑制劑格爾德霉素的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上改造而成的新型抗腫瘤藥物，與格爾德霉素相比，其毒性降低，穩(wěn)定性提高。17-AAG抗腫瘤的作用已被廣泛認(rèn)可。實(shí)驗(yàn)研究多與其他藥物或治療手段聯(lián)合，如聯(lián)合順鉑、吉西他濱、重離子輻射等[5]。

Sal與17-AAG為潛在化療藥物，在前期針對(duì)胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)，兩種藥物聯(lián)合使用可以通過(guò)調(diào)控凋亡過(guò)程誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞死亡。但兩藥聯(lián)合使用對(duì)乳腺癌的作用研究較少，聯(lián)合用藥是否可以通過(guò)調(diào)控凋亡改變癌細(xì)胞對(duì)藥物的敏感度，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖仍不清楚。本研究擬將Sal與17-AAG聯(lián)合用藥，探索其對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡的作用及其機(jī)制，旨在挖掘乳腺癌治療的新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系

人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 藥品與試劑

Sal，規(guī)格：80 mg，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所(批號(hào)K0141606)；17-AAG，規(guī)格：500 μg，購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司(批號(hào)100069-500UG)；細(xì)胞裂解液、蛋白質(zhì)定量試劑盒、CCK-8檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒均為碧云天生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司生產(chǎn); 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)( qPCR) 試劑盒，康潤(rùn)生物有限公司生產(chǎn)。RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清、胰酶+EDTA，美國(guó)HyClone公司生產(chǎn)；DMSO，上海索萊寶生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 設(shè)置實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組 ①實(shí)驗(yàn)組Sal單藥組：4 μmol/L；17-AAG單藥組：2 μmol/L；聯(lián)合用藥組：Sal 4 μmol/L+17-AAG 2 μmol/L；②對(duì)照組野生型乳腺癌細(xì)胞組：不做任何處理，正常培養(yǎng)，作為空白對(duì)照。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件：37℃、5%CO2飽和濕度。每天觀察細(xì)胞狀態(tài)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每1～2 d更換完全培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，可傳代、種板、凍存或進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 CCK8檢測(cè)MCF-7細(xì)胞增殖情況 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞，用0.25%胰酶消化后計(jì)數(shù)種于96孔板中，每孔約7000個(gè)細(xì)胞。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h后，棄去原培養(yǎng)基，更換為100 μL/孔溶有不同濃度藥物培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h及48 h后，分別棄去溶有藥物的培養(yǎng)基，重新加入溶有CCK8的培養(yǎng)基100 μL(每100 μL培養(yǎng)基含有10 μL CCK8溶液)。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。每組3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MCF-7凋亡情況 細(xì)胞消化后計(jì)數(shù)種于24孔培養(yǎng)板中，每孔 2×105個(gè)細(xì)胞，輕輕搖晃培養(yǎng)板使細(xì)胞分布均勻，培養(yǎng)板放入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱過(guò)夜，第2天待細(xì)胞匯合度約 70%～80%時(shí)進(jìn)行加藥處理。藥物處理48 h后收集細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為 5×105/mL，PBS清洗離心去上清后，分別加入500 μL Binding Buffer和FITC標(biāo)記的Annexin-V 5 μL，室溫避光30 min，加入PI 5 μL，避光反應(yīng)10 min后加入Binding Buffer 400 μL重懸，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)與凋亡相關(guān)基因表達(dá)情況 藥物處理48 h后分別提取未處理空白對(duì)照組、Sal單藥組、17-AAG單藥組及聯(lián)合用藥組總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR從基因水平檢測(cè)與細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Bax、Bcl-2、Beclin-1的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)使用 SPSS 19.0 (美國(guó)芝加哥)軟件處理。應(yīng)用t檢驗(yàn)或卡方檢驗(yàn)分析實(shí)驗(yàn)各組間的差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 聯(lián)合用藥對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響

根據(jù)“抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD)/對(duì)照組OD×100%”計(jì)算藥物對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的抑制率。加藥24 h后，Sal單藥組、17-AAG單藥組、聯(lián)合用藥組的抑制率為(3.36±0.01)%、(8.32±0.01)%、(7.48±0.02)%，抑制率無(wú)明顯差異；加藥后48 h其抑制率分別為(8.16±0.01)%、(9.91±0.01)%、(17.88±0.02)%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明加藥物48 h后，聯(lián)合用藥顯著抑制MCF-7細(xì)胞增殖(見(jiàn)圖1)。

圖1 各組細(xì)胞增殖抑制率

2.2 聯(lián)合用藥對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響

Sal與17-AAG聯(lián)合用藥組早期凋亡率為(6.42±1.70)% ，顯著高于空白對(duì)照組(4.24±0.90)%、Sal單藥組(4.79±0.89)%，以及17-AAG單藥組(2.78±1.10)%，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)圖2)。

圖2 鹽霉素聯(lián)合17-AAG誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡

2.3 凋亡相關(guān)基因表達(dá)情況

Bcl-2在聯(lián)合用藥組中的相對(duì)表達(dá)量為0.567±0.012，與空白對(duì)照、Sal單藥組、17-AAG單藥組相比，表達(dá)顯著降低(P<0.05)。而Caspase-3、Beclin-1、Bax在聯(lián)合用藥組中的相對(duì)表達(dá)量分別為1.82±0.10、1.89±0.09、1.74±0.12，均顯著高于其余三組對(duì)照組，組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)圖3)。

圖3 凋亡相關(guān)基因的表達(dá)情況

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，藥物聯(lián)合作用MCF-7細(xì)胞的凋亡率明顯上升，凋亡相關(guān)基因Beclin-1、Caspase-3、Bax表達(dá)量顯著增高、Bcl-2表達(dá)量顯著下調(diào)。相關(guān)研究提示Beclin-1是一種自噬基因，它與Bcl-2抗凋亡蛋白結(jié)合直接調(diào)控自噬和凋亡[6]；此外Bax是一種促凋亡基因，其基因表達(dá)受到P53調(diào)控，P53可上調(diào)促凋亡基因如Bax、PUMA、NOXA轉(zhuǎn)錄，抑制抗凋亡基因Bcl-2轉(zhuǎn)錄；P53還可轉(zhuǎn)錄激活A(yù)MPK通路而抑制mTOR誘導(dǎo)凋亡及自噬[7-8]，推測(cè)聯(lián)合用藥促進(jìn)乳腺癌MCF-7凋亡的機(jī)制可能為通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路如PI3K/Akt /mTOR、MAPK、JNK等，使Bcl-2磷酸化，從而釋放Beclin-1激活自噬；而B(niǎo)cl-2是抗凋亡基因，其又可以和Bax相互調(diào)節(jié)并促進(jìn)Caspase家族及其底物PARP的降解，從而影響凋亡。此外Caspase-3還可能通過(guò)剪切滅活Beclin-1抑制自噬促發(fā)凋亡[9]。

相關(guān)研究顯示Sal能克服腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐受，提高傳統(tǒng)化療藥物的敏感性，與多種抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡，如Sal與藜蘆醇聯(lián)合后ROS大量增加，導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞凋亡[10]。此外Sal還可以和酶抑制劑聯(lián)合使用，如與LBH589聯(lián)合后，可通過(guò)調(diào)控三陰性乳腺癌干細(xì)胞的周期及EMT誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[11]。17-AAG的主要抗腫瘤機(jī)制是可以通過(guò)特異性競(jìng)爭(zhēng)抑制 HSP-90 氨基端的ATP 酶活性，使HSP-90 處于 ADP 結(jié)合構(gòu)型，阻礙HSP-90 多分子伴侶復(fù)合體形成，導(dǎo)致泛素介導(dǎo)的HSP-90客戶蛋白廣泛降解，這些客戶蛋白中很多是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子，參與多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[12]。目前針對(duì)17-AAG對(duì)乳腺癌作用的相關(guān)機(jī)制還不多見(jiàn)，有學(xué)者猜測(cè)，AKT是HSP-90 的重要底物蛋白，17-AAG能直接影響AKT 的穩(wěn)定性并導(dǎo)致AKT 的缺失表達(dá)，從而有效地增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)化療的敏感度。

綜上所述，近年來(lái)Sal聯(lián)合其他化療藥物殺傷腫瘤細(xì)胞已逐漸成為腫瘤治療的新策略。但是Sal聯(lián)合用藥殺傷腫瘤細(xì)胞的具體機(jī)制還不清楚，進(jìn)一步闡明其作用機(jī)制將為聯(lián)合用藥進(jìn)入臨床和尋找有效藥物靶點(diǎn)打下堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。