孫 峰，王宇姣

(1.贛州市生態(tài)文明研究中心，江西 贛州 341000;2.贛州市章貢區(qū)建設(shè)投資集團(tuán)有限公司，江西 贛州 341000)

0 引 言

稀土有“工業(yè)維生素”之稱，具備特殊的物理化學(xué)性質(zhì)，廣泛應(yīng)用于工農(nóng)業(yè)、國防、醫(yī)學(xué)及新材料等眾多領(lǐng)域。隨著需求量的急增，稀土礦開發(fā)過程中的浸礦劑硫酸銨以及殘留稀土元素大量進(jìn)入周邊農(nóng)田土壤生態(tài)系統(tǒng)，其生態(tài)毒理效應(yīng)問題令人擔(dān)憂[1]。目前，國內(nèi)外有關(guān)污染物對(duì)蚯蚓的急性毒性效應(yīng)的研究，主要側(cè)重于重金屬復(fù)合污染[2-3]、農(nóng)藥[4]等，本試驗(yàn)通過自然土壤法[5-6]研究稀土釔及浸礦劑硫酸銨單一與復(fù)合污染對(duì)蚯蚓的急性效應(yīng)，直觀確定稀土元素釔與硫酸銨濃度對(duì)蚯蚓毒性的響應(yīng)關(guān)系，以期為稀土礦合理開采及浸礦劑合理使用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

(1)試驗(yàn)動(dòng)物：赤子愛勝蚓(Eisenia foetide)，購自市場。試驗(yàn)前蚯蚓置于實(shí)驗(yàn)室未污染土壤中馴化7 d，選擇體重為300～400 mg之間、具有環(huán)帶的健康成體的蚯蚓為供試品，且蚯蚓個(gè)休大小及重量基本相同。

(2)供試土壤：選用贛南區(qū)域未受稀土礦山開采影響，且水稻長勢良好的農(nóng)田土壤，采集后自然風(fēng)干，過20目篩待用。試驗(yàn)測定土壤理化性質(zhì)見表1。

表1 供試土壤理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of tested soil

(3)主要試劑：(NH4)2SO4(硫酸銨)、無水Y(NO3)3(硝酸釔)均為分析純。

(4)儀器設(shè)備：人工氣候箱，電子天平，純水蒸餾器，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，燒杯，培養(yǎng)皿，濾紙。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法[7]

(1)蚯蚓清腸：將直徑11 cm的濾紙鋪于1 L燒杯杯底，加少量蒸餾水，以剛浸沒濾紙為宜。挑選具有環(huán)帶的健康蚯蚓，清洗，放于燒杯中，用保鮮膜封口，解剖針扎孔。將燒杯置于溫度為(20±1)℃，濕度約75%的人工氣候箱中清腸1 d。

(2)試驗(yàn)設(shè)置：參照馮秀娟[8]等采用濾紙接觸法確定的稀土釔、硫酸銨對(duì)蚯蚓的半致死率濃度，并結(jié)合預(yù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，初步得到土壤中稀土釔、硫酸銨對(duì)蚯蚓的最大致死濃度LC100和最小致死濃度MLC，隨后確定兩種物質(zhì)在土壤中梯度濃度設(shè)置，具體正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2。

表2 稀土釔、硫酸銨復(fù)合處理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 Experimental design of compound treatment of rare earth yttrium and ammonium sulfate

(3)土壤染毒：根據(jù)上述試驗(yàn)設(shè)計(jì)的濃度梯度，將稀土釔及硫酸銨配制成相對(duì)應(yīng)濃度的溶液，取適量的稀土釔及硫酸銨溶液與500 g供試土壤混合，調(diào)節(jié)其土壤含水率為最大持水量的60%，放入溫度為(20±1)℃，濕度為(75±7)%，光照為1 333 Lx(間歇光照，即12 h光照，12 h黑暗)的人工氣候箱中平衡48 h后轉(zhuǎn)移到1 L燒杯中。每一濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，1個(gè)對(duì)照。

(4)培養(yǎng)：每一處理放入10條蚯蚓，并置于人工氣候箱中培養(yǎng)。

(5)觀察與統(tǒng)計(jì)：觀察時(shí)間為3、7、14 d。記錄死亡數(shù)及中毒癥狀，蚓體對(duì)針刺無反應(yīng)判為死亡。14 d后結(jié)束試驗(yàn)。

2 試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

2.1 稀土釔單一脅迫對(duì)蚯蚓的急性毒性

表3 自然土壤法稀土釔對(duì)蚯蚓的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of acute toxicity test of rare earth yttrium for earthworms by the natural soil method

各處理組中蚯蚓的死亡率隨著染毒時(shí)間的延長而增加，稀土釔濃度為1 100 mg/kg時(shí)，3 d、7 d及14 d時(shí)所得蚯蚓的死亡率分別為0、3.33%、16.67%，說明該濃度下稀土釔對(duì)蚯蚓的毒性較低，并且受染毒時(shí)間影響較?。划?dāng)濃度升為1 300 mg/kg時(shí)，3 d、7 d及14 d時(shí)所得蚯蚓的死亡率分別為5.33%、66.67%、96.67%，說明該濃度稀土釔對(duì)蚯蚓的毒性明顯增強(qiáng)，并受染毒時(shí)間影響較大，而且3 d到7 d蚯蚓死亡率從5.33%陡升至66.67%，說明稀土釔在一定量時(shí)對(duì)蚯蚓的毒性存在蓄積性；而當(dāng)濃度為1 500 mg/kg時(shí)，3 d、7 d及14 d時(shí)所得蚯蚓的死亡率分別為93.33%、100%、100%，說明該濃度下蚯蚓基本喪失生命力，毒性最大，且受染毒時(shí)間影響較小，試驗(yàn)前期蚯蚓就開始大面積死亡。為進(jìn)一步說明稀土釔的毒性大小，且對(duì)試驗(yàn)14 d后蚯蚓死亡率與稀土釔濃度關(guān)系進(jìn)行線性回歸分析，如圖1所示。

圖1 自然土壤法稀土釔濃度(14 d)對(duì)蚯蚓死亡率影響的線性回歸分析Fig.1 Linear regression analysis of the rare earth yttrium concentration(14 d)on earthworm mortality by natural soil method

得到蚯蚓死亡率(y)與稀土釔濃度(x)14 d的線性擬合方程：y=0.223 3x-221.66，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.902 9，其相關(guān)性都達(dá)到較顯著水平。

并由該方程求得自然土壤法稀土釔單一污染對(duì)蚯蚓的半致死率濃度LC50為1 216.57 mg/kg，這與試驗(yàn)中當(dāng)稀土釔濃度達(dá)到1 300 mg/kg后，蚯蚓表現(xiàn)出強(qiáng)烈的毒性應(yīng)激反應(yīng)且死亡率陡升的現(xiàn)象相一致。

2.2 硫酸銨單一脅迫對(duì)蚯蚓的急性毒性

硫酸銨單一脅迫對(duì)蚯蚓的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 自然土壤法硫酸銨對(duì)蚯蚓的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of acute toxicity test of ammonium sulfate for earthworms by natural soil method

各處理組中蚯蚓的死亡率隨著染毒時(shí)間的延長及硫酸銨處理濃度的增加而升高，當(dāng)硫酸銨濃度為3 800～4 100 mg/kg時(shí)，3 d內(nèi)蚯蚓未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，7 d時(shí)蚯蚓的平均死亡不到1條，14 d時(shí)蚯蚓平均死亡了不到3條，與對(duì)照組對(duì)比發(fā)現(xiàn)，說明該濃度組的硫酸銨對(duì)蚯蚓的毒性不明顯，甚至蚯蚓在土壤中表現(xiàn)活躍；當(dāng)濃度為4 400 mg/kg、4 700 mg/kg時(shí)，3 d時(shí)兩處理中蚯蚓死亡率相同都為33.33%，7 d時(shí)死亡率分別為43.33%、76.67%，14 d時(shí)死亡率分別53.33%、86.67%，說明兩處理濃度對(duì)蚯蚓的毒性作用開始顯示并受染毒時(shí)間影響，且4 700 mg/kg濃度處理組相比4 400 mg/kg濃度處理組中的蚯蚓應(yīng)激反應(yīng)顯著變得強(qiáng)烈，出現(xiàn)逃逸行為，部分蚯蚓從土壤中爬出到表面甚至燒杯壁上，且7 d時(shí)蚯蚓死亡率突升，發(fā)生毒性蓄積反應(yīng)；當(dāng)濃度達(dá)到5 000 mg/kg以上時(shí)，蚯蚓一放入土壤中不久即出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，7 d即基本全部死亡。

為進(jìn)一步說明硫酸銨的毒性大小，且對(duì)試驗(yàn)14 d后蚯蚓死亡率與硫酸銨濃度關(guān)系進(jìn)行線性回歸分析，如圖2所示。

圖2 自然土壤法硫酸銨濃度(14 d)對(duì)蚯蚓死亡率影響的線性回歸分析Fig.2 Linear regression analysis of the ammonium sulfate concentration (14 d)and earthworm mortality by natural soil method

得到蚯蚓死亡率(y)與硫酸銨濃度(x)14 d的線性擬合方程：y=0.060 3x-208.9，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.942 2，其相關(guān)性都達(dá)到較顯著水平。并由該方程求得自然土壤法硫酸銨單一污染對(duì)蚯蚓的半致死率濃度LC50為4 293.53 mg/kg，這與試驗(yàn)中當(dāng)硫酸銨濃度達(dá)到4 400 mg/kg后，蚯蚓表現(xiàn)出強(qiáng)烈的毒性應(yīng)激反應(yīng)且死亡率陡升，而小于4 100 mg/kg處理濃度組，蚯蚓表現(xiàn)正常甚至趨于活躍等現(xiàn)象相一致。

2.3 稀土釔、硫酸銨復(fù)合脅迫對(duì)蚯蚓的急性毒性

稀土釔、硫酸銨復(fù)合脅迫對(duì)蚯蚓的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果見表5。

圖3 自然土壤法硫酸銨影響下稀土釔14 d對(duì)蚯蚓急性毒性效果線性回歸分析Fig.3 Linear regression analysis of the acute toxicity(14 d) of rare earth yttrium for earthworms under the influence of ammonium sulfate by the natural soil method

低濃度3 800 mg/kg的硫酸銨與稀土釔復(fù)合染毒接觸蚯蚓時(shí)：14 d蚯蚓死亡率(y)與稀土釔濃度(x)的線性擬合方程為：y=0.156 7x-152.35，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.915 9，其相關(guān)性達(dá)到較顯著水平；并由該方程求得低濃度3 800 mg/kg的硫酸銨與稀土釔復(fù)合脅迫蚯蚓情況下蚯蚓的14 d理論LC50為1 291.32 mg/kg，略大于稀土釔單一染毒14 d對(duì)蚯蚓的半致死率濃度LC501 216.57 mg/kg；說明低濃度的硫酸銨稍微降低稀土釔對(duì)蚯蚓的毒性，產(chǎn)生輕微的拮抗作用。

中濃度4 400 mg/kg的硫酸銨與稀土釔復(fù)合染毒接觸蚯蚓時(shí)：14 d蚯蚓死亡率(y)與稀土釔濃度(x)的線性擬合方程為：y=0.186 7x-174.69，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.941 2，其相關(guān)性達(dá)到較顯著水平；并由該方程求得中濃度4 400 mg/kg的硫酸銨與稀土釔復(fù)合脅迫蚯蚓情況下蚯蚓的14 d理論LC50為1 203.48 mg/kg，亦略小于稀土釔單一染毒14 d的LC50。表明中濃度的硫酸銨稍微增加了稀土釔對(duì)蚯蚓的毒性，產(chǎn)生輕微的協(xié)同作用。

高濃度5 300 mg/kg的硫酸銨與稀土釔復(fù)合染毒接觸蚯蚓時(shí)：14 d蚯蚓死亡率(y)與稀土釔濃度(x)的線性擬合方程為：y=0.123 3x-78.995，性相關(guān)系數(shù)R2=0.917 5，其相關(guān)性達(dá)到較顯著水平；并由該方程求得高濃度5 300 mg/kg的硫酸銨與稀土釔復(fù)合脅迫蚯蚓情況下蚯蚓的14 d理論LC50為1 046.19 mg/kg，顯著小于稀土釔單一染毒14 d的LC50；表明高濃度的硫酸銨明顯增加了稀土釔對(duì)蚯蚓的毒性，產(chǎn)生顯著的協(xié)同作用。

3 結(jié) 論

綜上所述，稀土釔與硫酸銨對(duì)蚯蚓都存在一定毒性作用，蚯蚓的死亡率與染毒時(shí)間、2種污染物的濃度呈正比關(guān)系，且LC50隨染毒時(shí)間的延長而降低。同時(shí)，依據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》(GB/T 31270.7—2014)，通過LC50值來區(qū)分污染物毒性的大?。篖C50>10 mg/kg，試驗(yàn)測得稀土釔及硫酸銨單一染毒14 d對(duì)蚯蚓的LC50值分別為1 216.57 mg/kg、4 293.53 mg/kg，遠(yuǎn)大于10 mg/kg，因此稀土釔及硫酸銨對(duì)蚯蚓都屬于低毒性。但稀土釔屬于金屬元素，位于食物鏈底端的蚯蚓對(duì)其具有富集性，可能造成食物鏈的逐級(jí)富集，從而威脅高級(jí)生物甚至人類的健康。此外，稀土釔、硫酸銨的不同濃度組合，對(duì)蚯蚓的復(fù)合毒性或產(chǎn)生拮抗作用或協(xié)同作用，其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。