秦 雪，付世騫，楊鑫焱，楊 濤，高平聘，代曉斐，苗 超，滿朝新，姜毓君

（東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150030）

食品安全問題關(guān)乎民生之大計[1]。據(jù)估計，全球每年發(fā)生15億例微生物感染事件，造成460萬人死亡[2]，如2017年法國沙門氏菌污染事件[3]，2018年荷蘭奶粉阪崎腸桿菌污染[4]，以及后來的法國奶酪大腸桿菌污染事件[5]等，給人們帶來嚴重的生命財產(chǎn)損失。隨著食源性疾病在各國頻頻爆發(fā)，食品安全問題受到了廣泛重視。食源性致病菌主要有沙門氏菌、致病性大腸桿菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌以及單增李斯特菌等，人們誤食了食源性致病菌污染的食物后會產(chǎn)生嘔吐、腹瀉等癥狀，嚴重時會造成生命威脅[6]。因此，食物中食源性致病菌控制是保障食品安全的關(guān)鍵，而檢測技術(shù)的開發(fā)與應(yīng)用成為食源性致病菌控制的重要監(jiān)測手段。

傳統(tǒng)食源性致病菌檢測方法主要依靠平板菌落計數(shù)法，但該方法耗時長，操作繁瑣，而且靈敏度低，已不能滿足我國對致病菌快速檢測的要求。目前食源性致病菌的快速檢測方法主要有ELISA檢測[7]、膠體金免疫層析技術(shù)[8?9]以及分子檢測技術(shù)[10]，其中依賴于體外核酸擴增的分子檢測技術(shù)被認為是一種準確的檢測方式。重組酶聚合酶等溫擴增（recombinase polymerase amplification, RPA），作為一種新型等溫擴增技術(shù)，相比于傳統(tǒng)的聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction, PCR）、多重PCR等技術(shù)，擺脫了耗時長、操作繁瑣以及需要貴重儀器等缺點，實現(xiàn)高效、靈敏、甚至在資源緊缺的現(xiàn)場環(huán)境條件下對食源性致病菌的快速檢測。

本文將對RPA技術(shù)進行全面闡述，包括反應(yīng)機理、組成成分、引物探針設(shè)計方法以及靈敏度特異性等，并介紹了商業(yè)RPA反應(yīng)試劑盒。此外，本文總結(jié)近年RPA技術(shù)在食源性致病菌檢測中的應(yīng)用以及該技術(shù)發(fā)展的熱點，挖掘目前技術(shù)存在的優(yōu)勢與不足，并對RPA技術(shù)未來發(fā)展進行展望，旨在為RPA技術(shù)在食源性致病菌檢測領(lǐng)域提供更廣闊的思路。

1 RPA簡述

重組酶聚合酶等溫擴增是一種新型等溫擴增技術(shù)，于2006年由Piepenburg提出[11]，已被廣泛用于各種靶標的擴增，例如來自各種生物體和樣本的RNA、miRNA、ssDNA和dsDNA。盡管目前RPA技術(shù)在等溫擴增技術(shù)占比不是很大，但近十年來該技術(shù)發(fā)展最為迅速[12]。與環(huán)介導等溫擴增（LAMP,loop-mediated isothermal amplification）、滾環(huán)擴增（RCA, rolling circle amplification）、鏈置換擴增（SDA, strand displacement amplification）等等溫擴增技術(shù)相比，RPA引物設(shè)計簡單，僅需要兩條引物即可實現(xiàn)反應(yīng)。反應(yīng)所需溫度在37~42 ℃，甚至在室溫下也可實現(xiàn)擴增，并且可在20 min內(nèi)到達檢測水平[13?14]。該技術(shù)與其他擴增技術(shù)應(yīng)用于致病菌檢測方面的比較見表1，結(jié)果表明，RPA技術(shù)無論是在反應(yīng)時間，還是反應(yīng)溫度方面都表現(xiàn)出比其他核酸擴增更大的優(yōu)勢，并且具有良好的靈敏度，特別是資源匱乏的現(xiàn)場檢測。

表1 RPA與其他核酸擴增技術(shù)比較Table 1 Comparison of RPA and other nucleic acid amplification methods

1.1 反應(yīng)機理

RPA反應(yīng)機制依賴于同源重組過程[23]，是由TwistDx生物技術(shù)公司開發(fā)的一種新型體外等溫擴增技術(shù)。該技術(shù)主要包括三種重要組分：重組酶（如T4uvsX等）、單鏈結(jié)合蛋白（如T4 gp32等）以及DNA聚合酶（S. aureusPol等）。重組酶uvsX與引物在ATP存在的條件下結(jié)合，形成重組酶-引物復合體，該復合體可以識別目標雙鏈DNA模板上與引物互補的序列。重組酶將此位置的雙鏈DNA打開，發(fā)生鏈置換反應(yīng)并產(chǎn)生D-環(huán)狀結(jié)構(gòu)。此時，單鏈結(jié)合蛋白Gp32與被置換單鏈結(jié)合，防止再次形成雙鏈。隨后，重組酶-引物復合物主動水解體系中的ATP，導致該復合物構(gòu)象發(fā)生改變，此時引物3’端暴露出來，DNA聚合酶Bsu與引物3’端結(jié)合，啟動鏈延伸，形成新的互補鏈。在反應(yīng)過程中，上、下游兩條引物同時進行該反應(yīng)，不斷重復整個過程，實現(xiàn)產(chǎn)物DNA的指數(shù)增長。反應(yīng)原理如圖1。

圖1 RPA反應(yīng)原理Fig.1 Principle of RPA

1.2 引物及探針設(shè)計

引物設(shè)計是RPA的關(guān)鍵技術(shù)之一，主要包括三個步驟：選擇靶標區(qū)域，設(shè)計引物，引物篩選。但是迄今為止，還沒有可用的軟件來設(shè)計RPA的引物，因此目前RPA引物設(shè)計參考PCR引物設(shè)計方法，不同于常規(guī)PCR引物設(shè)計原則，RPA引物長度設(shè)計為30~35 bp，過短則會降低重組酶刺激以及完成RPA反應(yīng)的能力，影響反應(yīng)速度及靈敏度，過長易形成二級結(jié)構(gòu)，但目前也有成功應(yīng)用短的PCR引物（18~25 bp）實現(xiàn)RPA高靈敏度、高特異性擴增的研究，F(xiàn)uller等[24]設(shè)計PCR特異性引物并結(jié)合試紙條用于RPA反應(yīng)，證明了該引物在RPA反應(yīng)中具有優(yōu)于PCR反應(yīng)的靈敏度。大多數(shù)已報道的RPA擴增子長度為100~250 bp，同時也存在少數(shù)使用過短和過長引物實現(xiàn)擴增方法[11,25]。此外，引物設(shè)計要求GC含量40~70%，5’端3~5個核苷酸應(yīng)避免聚鳥嘌呤，引物濃度范圍應(yīng)在400~500 nmol/L之間[26]。

RPA探針的使用可以實現(xiàn)實時檢測、核酸信號放大，探針的位置應(yīng)處于上下游引物中間，并盡量避免下游引物與探針的重疊，探針濃度一般為120 nmol/L左右，設(shè)計方法可以參照TwistAmp?反應(yīng)套裝手冊[27]。該公司設(shè)計合成了用于熒光檢測的Exo探針和Fpg探針。這兩種熒光探針合成原理是用熒光基團和猝滅劑對探針標記，通過熒光基團與猝滅劑之間的脫堿基位點上熒光探針裂解而產(chǎn)生熒光。其中，前者結(jié)合Exo探針以及核酸外切酶III，實現(xiàn)實時定量RPA，不過該方法終點產(chǎn)物總量有所減少，更適合強熒光信號動力學分析，不適合終點檢測；后者添加了核酶fpg，熒光積累較慢，但終點產(chǎn)物總量不會減少，也可進行終點檢測。此外，該公司還開發(fā)了TwistAmp?nfo技術(shù)，加入核酶nfo，并結(jié)合橫向流動試紙，利用“三明治法”進行終點檢測。此外，目前絕大多數(shù)PCR探針不可直接用于RPA反應(yīng)，如聚合酶5’~3’核酸酶活性的探針系統(tǒng)，該酶活性與RPA系統(tǒng)完全不兼容，無法實現(xiàn)反應(yīng)的完成。

2 RPA技術(shù)在食源性致病菌檢測中的應(yīng)用現(xiàn)狀

RPA技術(shù)應(yīng)用廣泛，目前已有大量該技術(shù)與其他方法結(jié)合用于食源性致病菌檢測的研究出現(xiàn)，如實時熒光定量RPA（real-time RPA，RT-RPA）、RPA-橫向流動試紙條（RPA-lateral flow dipstick，RPA-LFD）、RPA-化學發(fā)光檢測、RPA-電化學檢測以及RPA-表面增強拉曼散射檢測等，本部分主要簡述這些方法在食源性致病菌檢測中的應(yīng)用。

2.1 實時熒光定量RPA

Real-time RPA（RT-RPA），是RPA基礎(chǔ)反應(yīng)體系與熒光探針結(jié)合起來的一種聯(lián)用技術(shù)，該技術(shù)依賴于核酸外切酶Ⅲ切斷Exo-探針中的四氫呋喃（THF），使該探針攜帶的熒光基團與淬滅基團分離，熒光信號增強，此時，酶切后產(chǎn)生的3’-OH作為DNA聚合酶的靶點，進一步擴增此探針，熒光強度不斷增強[28]，擴增過程中產(chǎn)生的熒光信號可由熒光信號檢測器或掃描儀實時檢測[29]，Exo-探針應(yīng)用于RT-RPA反應(yīng)原理如圖2。與RT-PCR比較，二者靈敏度與特異性相同，然而RT-RPA檢測時間明顯短于RT-PCR。王金鳳等[30]針對單增李斯特菌特異性基因LMhly A保守序列設(shè)計RPA引物和exo探針，在37 ℃等溫條件下20 min內(nèi)完成擴增，靈敏度達5×10?1pg且特異性良好。Liu等[31]針對ompA特異性基因設(shè)計特異性引物，實現(xiàn)了15 min內(nèi)快速檢測乳中阪崎克羅諾桿菌，檢測限為2.3×104CFU/mL，與RT-PCR結(jié)果相似。Geng等[32]根據(jù)空腸彎曲桿菌hipo基因設(shè)計引物和exo探針并建立RT-RPA方法，僅在13 min內(nèi)檢測到乳中空腸彎曲桿菌，檢測限102拷貝/反應(yīng)單元。RT-RPA因其靈敏度、特異性良好，反應(yīng)時間短，已有大量研究利用該方法建立食源性致病菌的檢測方法。

圖2 Exo探針用于RT-RPA原理圖[33]Fig.2 Principle of Exo probe for RT-RPA[33]

2.2 RPA-側(cè)流試紙（RPA-LFD）檢測

側(cè)流試紙是一種簡單可視化檢測裝置，可直接通過觀察試紙條檢測線、控制線顏色顯現(xiàn)情況或讀取灰度值來實現(xiàn)簡單的定性或半定量。該方法結(jié)合了免疫、分子雜交以及膠體金技術(shù)，生物素標記的核酸擴增產(chǎn)物與FAM標記的特異性探針雜交。FAM標記的特異性探針與抗FAM抗體的金標物結(jié)合，該復合物在試紙的毛細作用下擴散，在檢測線處生物素標記的擴增產(chǎn)物被生物素配體捕獲，而未被捕獲的復合物繼續(xù)擴散，在質(zhì)控線處被非特異性抗體捕獲，形成具有顏色的檢測線和質(zhì)控線。側(cè)流試紙的應(yīng)用主要分為兩種，對于大分子物質(zhì)的檢測一般采用三明治夾心法，對于小分子物質(zhì)的檢測則采用競爭法（圖3）。近年來，RPA-LFD因其操作簡單且無需專業(yè)儀器逐步成為目前研究較為成熟的一種技術(shù)。Liu等[34]、Xu等[35]、Hu等[22]建立了RPA-LFD檢測牛奶中的沙門氏菌，檢出限分別為1.05、4和1.95 CFU/mL。2019年，高建欣等[36]根據(jù)金黃色葡萄球菌保守的nuc基因設(shè)計特異性引物，將RPA與乳膠微球試紙條（LMTS）相結(jié)合檢測金黃色葡萄球菌，檢測限為1.2×10 CFU/mL，特異性良好。在實際樣品檢測中，經(jīng)過3 h預(yù)增菌后，RPA-LMTS檢測限可達1.2×102CFU/mL（g）。2020年，Hu等[37]和Wang等[38]利用RPA-LFD分別檢測了牛奶中的大腸桿菌和單核增生李斯特菌，檢測限達到4.4 CFU/mL和1 CFU/50 μL，結(jié)果均低于PCR-LFD方法檢測限（1.05×10 CFU/mL）。結(jié)果表明，RPA-LFD方法的檢出限低、靈敏度高、檢測時間短，且結(jié)果可直接通過肉眼觀察，非常適合資源有限的現(xiàn)場檢測，具有良好的應(yīng)用前景。但是RPA-LFD的缺點是RPA產(chǎn)物需進行稀釋，否則產(chǎn)物會對試紙條上的抗體產(chǎn)生干擾，并且反應(yīng)處于開放環(huán)境，容易引起假陽現(xiàn)象。此外，可以使用一些簡單的加熱設(shè)備，以實現(xiàn)更精確的現(xiàn)場檢測。

圖3 RPA-LFD檢測原理圖Fig.3 Principle of RPA-LFD

2.3 RPA-化學發(fā)光檢測

化學發(fā)光原理是將氧化或水解反應(yīng)產(chǎn)生的化學能轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢姽?，與一些基于熒光探針檢測方法相比，化學發(fā)光檢測更靈敏、更穩(wěn)定，是與便攜式檢測設(shè)備（如智能手機）相結(jié)合的良好選擇。但是，目前化學發(fā)光檢測多用于病毒以及臨床治療方面，圖4是Kunze等[39]提出的一種基于流式化學發(fā)光微陣列的芯片結(jié)合RPA方法檢測兩種病毒以及糞腸球菌，微陣列上的斑點可特異性識別微生物，通過產(chǎn)生的熒光信號對這三種微生物DNA進行定量，48 min內(nèi)檢測限達到5×103GU/μL，靈敏度與qPCR相當，表明RPA-化學發(fā)光方法使三種微生物同時檢測成為可能。Jonas等開發(fā)一種有ED-2003涂層的聚碳酸酯芯片，將現(xiàn)有的基于流動化學發(fā)光微陣列測量原理由玻片轉(zhuǎn)移到聚碳酸酯芯片上，使化學發(fā)光從微陣列層面走向常規(guī)分析，更具有普適性，并采用不對稱RPA方法獲得更強的發(fā)光信號，對嗜肺軍團菌檢測限為0.35 ng/L[40]，與微陣列-ELISA結(jié)果一致。目前，RPA-化學發(fā)光方法應(yīng)用于食源性致病菌的檢測仍處于發(fā)展初期階段，更多基于化學發(fā)光的微型化檢測裝置有待開發(fā)。

圖4 RPA-化學發(fā)光檢測原理圖[39]Fig.4 Principle of RPA-Chemiluminescence detection[39]

2.4 RPA-電化學檢測

電化學檢測是利用電化學活性物產(chǎn)生和放大核酸信號。目前大多數(shù)是根據(jù)ELISA原理,將可溶性的抗原或抗體吸附到電極上，通過檢測電流信號實現(xiàn)定性或定量，整個過程無需電泳和產(chǎn)物純化，短時間內(nèi)可完成整個檢測。Del等通過ELISA電化學實驗證明了電化學檢測是光學檢測靈敏度的5倍[41]。因此，RPA-電化學檢測具有較高的分析靈敏度，檢測速度快、成本低，可使用廉價材料如碳電極等以及采用便攜式設(shè)備（如STAT 400雙恒電阻器/恒流器）即可完成信號檢測，非常適合現(xiàn)場檢測使用。目前已有的電化學-RPA技術(shù)主要用于檢測抗菌素耐藥基因[42]、病毒[43]等，在食源性致病菌檢測中的應(yīng)用鮮有報道。2014年報道了一篇電化學結(jié)合固相RPA法檢測土拉弗朗西斯菌[41]，其原理圖見圖5，利用辣根過氧化物酶（HRP）催化特性，在過氧化氫存在下將無色TMB氧化為藍色物質(zhì)，將化學反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘枺瑱z測限為4×106拷貝/50 μL，比常規(guī)電化學-RPA方法的檢測限低，可能是因為受到固相以及基質(zhì)干擾等的影響，但是該方法具有良好的特異性。未來仍需要大量基于RPA-電化學技術(shù)用于對檢測食源性致病菌的研究以填補該方面的空缺。

圖5 RPA-電化學檢測原理圖[41]Fig.5 Principle of RPA-electrochemical detection[41]

3 RPA技術(shù)在食源性致病菌檢測中發(fā)展熱點

隨著RPA技術(shù)的快速發(fā)展，其應(yīng)用及檢測系統(tǒng)也越來越多樣化。本文針對RPA檢測的熱點應(yīng)用進行了概述，以期實現(xiàn)真正的現(xiàn)場檢測。

3.1 數(shù)字RPA

數(shù)字RPA原理是將液體分散在油相中從而產(chǎn)生很多液滴，每個產(chǎn)生的液滴充當一個單獨的微型反應(yīng)器，其中包含微型RPA反應(yīng)的所有試劑，該方法可實現(xiàn)對初始核酸的絕對定量，不依賴校準曲線，與RT-RPA相比可得到更準確的結(jié)果。2015年，Schuler等[44]首次實現(xiàn)數(shù)字液滴RPA（ddRPA），成功地量化了單核增生李斯特菌DNA（100、215、464和1000拷貝），與數(shù)字液滴PCR檢測結(jié)果一致。Tsaloglou等[45]設(shè)計了一種滑動芯片來檢測艱難梭狀芽胞桿菌，可同時進行8個RPA平行試驗，檢測限達到103拷貝。而Shen等[46]開發(fā)一種可同時進行1550個平行RPA反應(yīng)的滑動芯片用來檢測耐甲氧基西林金黃色葡萄球菌，靈敏度達到300拷貝/mL。由此可見，數(shù)字RPA在致病菌檢測中正朝著高通量、快速的方向發(fā)展。多通道數(shù)字RPA與熒光檢測集成在一個芯片中就是一個成功的例子，該方法無需建立污染牛奶標準曲線，45 min內(nèi)即可檢測出大腸桿菌O157:H7、單核增生李斯特菌和沙門氏菌，實現(xiàn)了對食源性細菌的快速、多通道、準確檢測[47]。

3.2 多重RPA

在一些特定的條件下，單一致病菌的檢測已不能滿足快速檢測的要求。多重RPA檢測方法的開發(fā)在實現(xiàn)高通量檢測致病菌方面具有重要意義。Santiago-Felipe等[48]以一種簡單便攜的檢測系統(tǒng)為例，首次將RPA與光盤技術(shù)的結(jié)合，其建立了同時檢測牛奶中沙門氏菌和克羅諾桿菌的檢測方法，可以同時以最低檢測成本和最小操作單元實現(xiàn)對不同目標的快速檢測。Chen等[49]構(gòu)建一種離心式芯片，將DNA提取、RPA和熒光檢測結(jié)合，40 min內(nèi)同時檢測尿液樣本中五種主要致病菌。Choi等[50]將碟式微流控芯片與RPA技術(shù)結(jié)合，將凍干的探針提前預(yù)載于反應(yīng)室中，通過熒光檢測裝置讀取熒光信號，在30 min內(nèi)成功檢測出牛奶中的沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7和副溶血性弧菌，整個試驗無需樣品預(yù)處理，靈敏度為1.25細胞/L，節(jié)省時間和成本，靈敏度特異性良好，但該技術(shù)無法擺脫對熒光儀器的依賴，在資源有限的現(xiàn)場檢測中應(yīng)用受限。目前，多重RPA檢測朝著更快速、前處理更簡便的方向發(fā)展。

3.3 微型化RPA

為了適用于現(xiàn)場（point of care，POTC）檢測，檢測設(shè)備微型化也逐漸成為主流，以實現(xiàn)更加快速、靈敏、特異性高的檢測。目前已有大量研究報道將微流體設(shè)備與RPA結(jié)合，將樣品制備、擴增與信號檢測集成為一體來檢測致病菌。Renner等[2]開發(fā)了一種低成本、便攜、易操作的熒光RPA微流體系統(tǒng)，同時檢測糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌以及腸桿菌，特異性良好。2012年，Oordt等[51]研制出一臺全集成微流控設(shè)備，從DNA提取到檢測整個過程是全自動的，在45 min內(nèi)可實現(xiàn)對炭疽芽孢桿菌和弗朗西斯氏菌的檢測。Kim等[52]開發(fā)了一種離心微流體，其集樣品裂解、RPA擴增、測定、稀釋和側(cè)流條帶檢測于一體，用于沙門氏菌的檢測，30 min內(nèi)實現(xiàn)在PBS以及牛奶中檢測限分別達到10 CFU/mL和100 CFU/mL。Choi等[50]在一個基于箔的微流體上建立了集成RPA方法，直接采用PCR緩沖液裂解細胞，以RPA反應(yīng)一步檢出沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7以及副溶血性弧菌，簡化了樣品前處理的步驟。因此，微流控RPA方法的開發(fā)是實現(xiàn)全自動化的一個過渡，更適用于資源匱乏、非專業(yè)人員操作等條件下的現(xiàn)場檢測。但是樣品前處理問題仍然是亟待解決的瓶頸。

4 總結(jié)與展望

PCR技術(shù)是核酸檢測的一次重大革命，而RPA技術(shù)因其溫度要求低、檢測速度快成為未來可能替代PCR技術(shù)的技術(shù)之一，該技術(shù)雖然引入較晚，但發(fā)展非常迅速。本文從原理、引物及探針設(shè)計，并結(jié)合目前針對食源性致病菌檢測的實際應(yīng)用以及研究熱點對RPA技術(shù)進行綜述，提出利于RPA技術(shù)未來發(fā)展方向的建議。

RPA技術(shù)雖然發(fā)展之勢迅猛，但仍存在明顯問題。第一，目前RPA技術(shù)大多停留在實驗室層面，在現(xiàn)場檢測的應(yīng)用還有所欠缺，因此，RPA的發(fā)展應(yīng)更加關(guān)注于樣品前處理以及便攜式、全自動等問題，以更有利于現(xiàn)場檢測，提高檢測效率。第二，缺少專門針對RPA反應(yīng)引物設(shè)計的軟件或網(wǎng)站以簡化引物和探針的設(shè)計，因此，在未來的一段時間內(nèi)RPA技術(shù)不會完全取代PCR技術(shù)。第三，目前研究基本采用TwistDX公司開發(fā)的試劑盒，存在著成本較高的問題，如何降低成本也是RPA未來發(fā)展的一大方向。第四，RPA反應(yīng)由復雜酶系參與，酶活力是保障實驗成功的關(guān)鍵因素，但是該酶系易熱失活，因此，在現(xiàn)場檢測中酶系的儲存方式以及酶活力對RPA反應(yīng)影響有待研究。最后，由于RPA反應(yīng)溫度接近于人的體溫，未來可以嘗試開發(fā)依靠體溫進行RPA擴增以實現(xiàn)對食源性致病菌的人體自檢。本研究發(fā)現(xiàn)，目前RPA技術(shù)在食源性致病菌檢測中仍存在很多空白有待深入研究，需要更多RPA結(jié)合新技術(shù)檢測致病菌方法的開發(fā)，尤其是電化學以及表面拉曼增強散射方法的應(yīng)用。隨著RPA技術(shù)的不斷完善，其前景將會更加廣闊。