王文平，熊英梅，陳賽浙，侯強川，劉忠軍，郭 壯,

（1.湖北文理學院，湖北省食品配料工程技術研究中心，湖北襄陽 441053；2.湖北堯治河楚翁泉酒業(yè)有限公司，湖北襄陽 441600；3.襄陽市釀酒生物技術與應用企校聯合創(chuàng)新中心，湖北襄陽 441053）

米酒曲通常是在特定的生態(tài)環(huán)境內，用成曲在開放體系中培養(yǎng)生產而成，含有豐富的微生物種類和酶系[1]。米酒曲在米酒發(fā)酵過程中起發(fā)酵和糖化生香作用，并最終決定了成品酒的產率和品質風味[2]。米酒曲中主要存在霉菌、酵母菌和細菌3個微生物類群，其中霉菌可降解淀粉和發(fā)酵糖類等物質，酵母菌可將糖類物質轉化成酒精，而細菌則賦予米酒獨特的風味品質[3]。按照傳統(tǒng)方式制作的米酒曲受“母種”質量的影響較大，加之季節(jié)氣候、生產和地理環(huán)境等綜合因素的影響，故而米酒曲的質量參差不齊，且容易混入產毒性的菌株[4]。蔡海鶯等[5]通過對12種甜米酒酒曲細菌類群進行分離鑒定和測序發(fā)現，其含有大量芽孢桿菌（Bacillus）、少量的病原菌和腐敗菌。

近年來，以MiSeq等第二代高通量測序技術為代表的分子生物學手段被廣泛應用于米酒[6]、泡菜[7]和臭豆腐[8]等發(fā)酵食品微生物群落結構的解析中，在非優(yōu)勢和不可培養(yǎng)微生物類群檢測方面具有較大優(yōu)勢，有效彌補了傳統(tǒng)純培養(yǎng)方式的不足。本研究以采集自廣西壯族自治區(qū)南寧市和湖北省孝感市的米酒曲為研究對象，在采用Illumina MiSeq高通量測序技術對其細菌多樣性進行解析的基礎上，進一步采用BugBase軟件對其細菌類群的表型進行分析，以期為后續(xù)米酒品質和安全性的提升提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

廣西壯族自治區(qū)南寧市米酒曲樣本 分別采集自淡村農貿市場（108°31′E，22°78′N）、瑯東農貿市場（108°38′E，22°82′N）、仙 葫 農 貿 市 場（108°44′E，22°81′N）；湖北省孝感市米酒曲樣本 分別采集自大東門農貿市場（113°92′E，30°92′N）、嚴橋市場（113°94′E，30°94′N）。每個地區(qū)采集米酒曲樣本10個，合計采集20個；所有米酒曲樣本均以糯米為原料制作而成，部分樣本中含有辣蓼草等中草藥；基因組提取試劑盒 德國QIAGEN公司；Fast-Pfu Fly DNA Polymerase、FastPfu Fly DNA聚合酶（5 U/μL）、dNTPs Mix 北京全式金生物技術有限公司。

vetiri梯度基因擴增儀 美國ABI公司；MiSeq高通量測序平臺 美國Illumina公司；ND-2000C微量紫外分光光度計 美國Nano Drop公司；R930機架式服務器 美國DELL公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 宏基因組DNA的提取、PCR擴增及Illumina高通量測序 取1.0 g研磨碎的米酒曲樣本使用DNA提取試劑盒進行宏基因組DNA提取，按照Wang等[9]方法進行16S rRNA V3~V4區(qū)擴增，合格的PCR產物送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司使用MiSeq PE300平臺測序。

1.2.2 生物信息學分析 參照Wang等[10]的方法對序列進行拼接和質控，使用QIIME（v1.9.1）平臺[11]對質控后的數據進行多樣性評價，使用PyNAST[12]將序列對齊，使用UCLUST兩步法建立操作分類單元（Operational taxonomic units，OTU）[13]，使用SILVE數據庫[14]、Greengene數據庫[15]和RDP（Ribosomal Database Project，Release 11.5）數據庫[16]確定細菌分類學地位。

1.2.3 核酸登錄號 本研究中所有序列數據已提交至MG-RAST數據庫，ID號為mgp97489。

1.3 數據處理

使用R軟件的ggpubr包和ggplot2包繪制香農指數（Shannon Index）、辛普森指數（Simpson Index）和發(fā)現物種數（Observed Species）的小提琴圖，使用柱形圖評估米酒曲中優(yōu)勢細菌門和屬的相對含量及其分布，采用威爾科克森符號秩（Wilcoxon）檢驗進行顯著性分析，基于加權和非加權距離主坐標分析多元方差分析（multivariate analysis of variance，MANOVA）解析2個地區(qū)米酒曲細菌類群的β多樣性，使用R軟件的UpSetR包基于OTU水平分析不同樣本間OTU的分布，將OTU矩陣與樣本的分類信息上傳至BugBase網站（https://bugbase.cs.umn.edu/）進行表型預測。

2 結果與分析

2.1 不同地區(qū)米酒曲細菌類群α和β多樣性的比較分析

本研究采用Illumina高通量測序技術對20個米酒曲樣本進行測序，共得到高質量序列686478條，平均每個樣本34324條。香農指數、辛普森指數和發(fā)現物種數是評價α多樣性的重要指標。兩個地區(qū)米酒曲樣本的α多樣性結果如圖1所示。

由圖1可知，南寧地區(qū)米酒曲細菌類群的香農指數顯著低于孝感地區(qū)（P<0.05），但兩者的辛普森指數和發(fā)現物種數并無顯著性差異（P>0.05）。由此可見，南寧地區(qū)米酒曲細菌類群的多樣性偏低。

圖1 不同地區(qū)米酒曲香農指數（A）、辛普森指數（B）和發(fā)現物種數（C）α多樣性指標比較分析Fig.1 Comparative analysis of α diversity indexes including Shannon index (A), Simpson index (B) and the number of observed species (C) of rice wine koji from different regions

本研究進一步對2個地區(qū)米酒曲細菌類群的β多樣性進行了解析，結果如圖2所示。

由圖2A可知，雖然2個地區(qū)的米酒曲樣本在空間排布上存在部分交疊現象，但整體呈現分離趨勢，經MANOVA檢驗發(fā)現2個地區(qū)米酒曲細菌群落結構差異顯著（P<0.05）。由圖2B可知，雖然2個地區(qū)樣本在空間排布上亦呈現出明顯的分離趨勢，其中南寧地區(qū)樣本聚集為三簇，而孝感地區(qū)聚集為兩簇，但經MANOVA檢驗發(fā)現兩者差異并不顯著（P>0.05）。由此可見，2個地區(qū)米酒曲蘊含細菌類群的種類具有相似性，但其豐度可能存在一定差異。鑒于上述分析結果，本研究進一步在分類學地位“門”和“屬”水平上對2個地區(qū)米酒曲細菌類群進行了比較分析。

圖2 基于加權（A）和非加權（B）UniFrac距離的主坐標分析Fig.2 Principal coordinate analysis based on weighted (A) and unweighted (B) UniFrac distance

2.2 不同地區(qū)米酒曲細菌類群門、屬結構分析

南寧和孝感地區(qū)米酒曲相對含量大于1.0%細菌門的構成如圖3所示。

由圖3可知，南寧地區(qū)米酒曲中平均相對含量>1.0%的細菌門為Firmicutes（厚壁菌門，94.58%）和Proteobacteria（變形菌門，5.14%），孝感地區(qū)為Firmicutes（厚壁菌門，83.01%）、Proteobacteria（變形菌門，15.15%）和Cyanobacteria（藍細菌，1.07%）。由圖3可知，兩個地區(qū)的米酒曲樣本中隸屬于Firmicutes和Proteobacteria的細菌類群含量差異顯著（P<0.05）。相對含量>1.0%的細菌屬及其顯著性分析如圖4所示。

圖3 不同地區(qū)米酒曲相對含量>1.0%的細菌門及顯著性分析Fig.3 Bacterial phyla with relative abundance >1.0% of rice wine koji from different regions and their significance analysis

由圖4可知，南寧地區(qū)米酒曲中平均相對含量>1.0%的細菌屬為Lactobacillus（乳桿菌屬，62.03%）、Weissella（魏斯氏菌屬，16.29%）、Lactococcus（乳球菌屬，9.74%）、Pediococcus（片球菌屬，2.64%）、Leuconostoc（明串珠菌屬，2.36%）、Salmonella（沙門氏菌屬，2.28%）和Gluconobacter（葡糖桿菌屬，1.45%），孝感地區(qū)米酒曲為Weissella（魏斯氏菌屬，50.14%）、Lactococcus（乳球菌屬，15.42%）、Lactobacillus（乳桿菌屬、5.08%）、Pediococcus（片球菌屬，4.55%）、Leuconostoc（明串珠菌屬，3.07%）、Enterobacter（腸桿菌屬，2.88%）、Macrococcus（巨型球菌屬，2.86%）、Staphylococcus（葡萄球菌屬，2.08%）、Acinetobacter（不動桿菌屬，1.43%）、Salmonella（沙門氏菌屬，1.41%）和Acetobacter（醋酸桿菌屬，1.11%）。由此可見，南寧地區(qū)米酒曲細菌類群以Lactobacillus為主，而孝感地區(qū)以Weissella為主，經Wilcoxon檢驗發(fā)現上述兩個屬在不同地區(qū)米酒曲中的相對含量差異均極顯著（P<0.001）。除此之外，孝感地區(qū)米酒曲中Enterobacter的相對含量高度顯著偏高（P<0.01）。由此可見，雖然同一細菌屬在兩個地區(qū)米酒曲中均存在，但其相對含量存在較大差異，這也與圖2得到的結論一致。

圖4 不同地區(qū)米酒曲相對含量>1.0%的細菌屬及顯著性分析Fig.4 Bacterial genera with relative abundance >1.0% of rice wine koji from different regions and their significance analysis

乳酸菌能夠產生乳酸菌素等物質，在米酒的發(fā)酵過程中能夠抑制雜菌的生長[17]。米酒酸味的主要來源是乳酸菌產生的乳酸，而乳酸和乙醇反應生成酯類是米酒主要的風味來源，同時在乳酸菌的代謝過程中產生乙酰和雙乙酰，賦予米酒特殊的風味[18]。Jiao等[19]采用變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技術對米酒細菌類群進行研究發(fā)現，參與發(fā)酵的乳酸菌多樣性越高則米酒的感官特性酒越好，因而在米酒發(fā)酵過程中提高乳酸菌的多樣性有利于提高米酒的感官品質。Lactobacillus和Weissella均為乳酸菌，向凡舒研究指出Lactobacillus fermentum（發(fā)酵乳桿菌）、Lactobacillus agilis（能動乳桿菌）和Lactococcus lactis（乳酸乳球菌）為湖北省孝感地區(qū)米酒中優(yōu)勢乳酸菌，Weissella cibaria（食竇魏斯氏乳酸菌）、Lactobacillus johnsonii（約漢遜氏乳桿菌）和Lactobacillus brevis（短乳桿菌）為四川省成都地區(qū)米酒中優(yōu)勢乳酸菌，不同地區(qū)米酒中乳酸菌的類群存在一定的差異[20]。由此可見，米酒和米酒曲中的優(yōu)勢細菌類群均為乳酸菌，乳酸菌的類群構成對米酒的風味品質形成影響較大。

2.3 基于OTU水平不同地區(qū)米酒曲細菌類群分析

經過100%和97%相似度進行OTU劃分后共得到3366個OTU，樣本中的OTU分布結果如圖5所示。

圖5 OTU在不同樣本中的分布Fig.5 Distribution of OTUs in different samples

本研究發(fā)現僅有1個OTU在所有米酒曲樣本中均存在，隸屬于Weissella，其在南寧和孝感地區(qū)米酒曲中的平均相對含量分別為1.35%和8.77%，地區(qū)之間差異并不顯著（P>0.05）；有2個OTU在19個樣本中存在，分別隸屬于Staphylococcus和Pediococcus，累計平均相對含量為3.16%；有6個OTU在18個樣本中存在，隸屬于Lactobacillus、棒形桿菌屬（Clavibacter）和Weissella，累計平均相對含量為34.09%。有1085個OTU僅存在一個樣本中，包含序列條數僅有13419條，僅占所有序列條數的2.00%，但并沒有OTU僅存在某一地區(qū)所有米酒曲中。由此可見，南寧和孝感地區(qū)的米酒曲雖然各自含有少量獨特的細菌類群，但更多的是共有大量的細菌類群。

2.4 不同地區(qū)米酒曲細菌類群表型結果分析

將OTU矩陣與樣本的分類信息上傳至BugBase網站進行表型預測，結果如圖6所示。

由圖6可知，南寧地區(qū)米酒曲中革蘭氏陽性菌含量高度顯著高于孝感地區(qū)（P<0.01），而在氧化脅迫耐受、生物膜形成、革蘭氏陰性以及兼性厭氧方面呈現出高度顯著的相反趨勢（P<0.01）。雖然兩個地區(qū)米酒曲中均存在一定數量的致病菌，但是南寧地區(qū)米酒曲中致病菌的致病潛力要高度顯著低于孝感地區(qū)（P<0.01）。農戶家自制的米酒曲方式較為傳統(tǒng)，且制作方式較為開放，環(huán)境中的病原菌或其他微生物混入米酒曲之中可能造成米酒曲的污染，因而對米酒曲的制作方式進行規(guī)范化，保持環(huán)境衛(wèi)生和篩選優(yōu)良特性的發(fā)酵菌株對于提升米酒的品質和安全性均具有積極意義。

3 結論

南寧地區(qū)米酒曲細菌類群以Lactobacillus為主，而孝感地區(qū)以Weissella為主，且南寧地區(qū)米酒曲細菌類群的多樣性偏低。雖然南寧和孝感地區(qū)米酒曲細菌群落結構存在明顯的差異，但這種差異主要是由于同一細菌類群在2個地區(qū)樣本中的含量不同導致的，每個地區(qū)米酒曲中并不含有太多獨特的細菌類群。