李一鳴，王少林

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193)

抗生素是目前臨床上治療感染性疾病的重要武器之一，但隨著抗生素在臨床及畜禽生產(chǎn)上的重復(fù)使用，耐藥菌的種類和數(shù)量都在逐年上升，臨床上不僅出現(xiàn)了多重耐藥菌(Multi-drug resistant bacteria，MDR)、廣泛耐藥菌(Extensively drug resistant，XDR)，還出現(xiàn)了泛耐藥菌(Pandrug resistant bacteria，PDR)。一些化合物已經(jīng)被開發(fā)或重新應(yīng)用于革蘭陽性耐藥菌的治療，但有很大的局限性；而革蘭陰性多重耐藥菌的感染更為可怕，目前臨床上還沒有可用于這些感染的新藥物[1]。多黏菌素是治療多重耐藥革蘭陰性菌最重要的藥物之一，隨著其在人類臨床上的廣泛運(yùn)用，多黏菌素耐藥基因開始在世界范圍內(nèi)出現(xiàn)，人類臨床及獸醫(yī)臨床面臨著前所未有的危機(jī)和挑戰(zhàn)[2]。

目前，多黏菌素耐藥基因mcr在世界各地的動(dòng)物、食物以及人類的腸桿菌科細(xì)菌中均有發(fā)現(xiàn)，其中包括了北美洲、北非、南洋和歐洲[3-4]。這類耐藥基因可以在細(xì)菌之間通過質(zhì)粒傳播，加速了多黏菌素耐藥基因的傳播速度，對人類健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的威脅，目前急需一種快速檢測方法，為未知樣品中的mcr基因檢測提供依據(jù)。相對于傳統(tǒng)PCR而言，實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有更高的特異性和敏感性，且操作簡便[5-6]。目前，mcr-1/2/3/4/5/8在國內(nèi)外被多次報(bào)道，且具有較高的流行率。本實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)構(gòu)建了mcr-1/2/3的實(shí)時(shí)熒光定量檢測方法，而mcr-4/5/8的相關(guān)方法還未構(gòu)建，本試驗(yàn)針對mcr-4/5/8基因建立了相應(yīng)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，以便于對動(dòng)物以及環(huán)境樣本中多黏菌素耐藥基因進(jìn)行定性與定量檢測。

1 材料與方法

1.1 模板、樣本和載體mcr-1/2/3/4/5/8陽性模板由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)獸醫(yī)系藥理與毒理研究室保存。24份環(huán)境樣本來自 2018 年重慶育肥豬場和蛋雞養(yǎng)殖場，為糞便和土壤樣品。5 份mcr-8 陽性菌液和 3 份mcr-8 陰性菌液來自2018 年青島豬場和雞場，均為肺炎克雷伯菌。感受態(tài)細(xì)胞DH5α、pMD19-T載體，均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 主要試劑 QIAGEN?Plasmid Mini Kit試劑盒，購自優(yōu)寶生物科技有限公司；PowerSoil?DNA Isolation Kit試劑盒，購自美國MO BIO公司；2×TaqTMPCR Master Mix，購自寶生物工程(大連)有限公司；PowerUPTMSYBR?Green Master Mix 試劑盒，購自美國 Thermo 公司；Wizard?SV Gel and PCR Clean-Up System試劑盒，購自北京普洛麥格生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器 熒光定量PCR儀Q7，購自美國ABI公司；NanoDrop，購自美國Thermo公司。

1.4 引物設(shè)計(jì)和驗(yàn)證 首先在NCBI上下載試驗(yàn)中需要的mcr-4/5/8基因的完整序列，使用Primer3plus系統(tǒng)設(shè)計(jì)本次試驗(yàn)所需要的實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性引物(表1)，并查看其特異性，之后再通過傳統(tǒng)PCR的方式對其特異性進(jìn)行驗(yàn)證，本次試驗(yàn)所用引物均由北京博邁德有限公司合成。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物Table 1 Primers of real-time PCR

1.5 基因克隆 利用所設(shè)計(jì)的特異性引物分別對mcr-4/5/8陽性模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳并切膠回收。將高質(zhì)量的膠回收產(chǎn)物與pMD19-T載體連接，構(gòu)成重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，通過藍(lán)白斑篩選的方式篩選出成功的轉(zhuǎn)化子，并對其進(jìn)行驗(yàn)證。對轉(zhuǎn)化成功的細(xì)菌純化后進(jìn)行質(zhì)粒的提取。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 使用NanoDrop測定標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的濃度，根據(jù)質(zhì)?？截悢?shù)計(jì)算公式，計(jì)算各樣品中重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)。拷貝數(shù)(Copies/mL)=(L×C)/(N×M×109)，L為阿伏伽德羅常數(shù)，C為重組質(zhì)粒濃度，N為目的片段加上載體片段的長度，M為每對堿基的平均分子量(660/bp)。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋，取不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板。對實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系中各組分濃度和退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，以獲得最低的Ct值和較高的熒光強(qiáng)度增加值。利用優(yōu)化好的條件通過SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 方法特異性的檢測 利用建立的方法對1株mcr-4陽性模板、1株mcr-5陽性模板、5株mcr-8陽性菌液以及3株mcr-8陰性菌液(8份菌液為2018年青島豬場和雞場分離的肺炎克雷伯菌)進(jìn)行盲選，觀察檢測結(jié)果是否與之前的測序結(jié)果相一致。同時(shí)對24份環(huán)境樣品(樣本來自2018年重慶育肥豬場和蛋雞養(yǎng)殖場，共24份糞便和土壤樣本)進(jìn)行檢測，根據(jù)檢查結(jié)果來判定所建立方法的特異性和靈敏度。

2 結(jié)果

2.1 引物設(shè)計(jì)與驗(yàn)證 對所設(shè)計(jì)的mcr-4/5/8引物的特異性進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如中插彩版圖1所示，凝膠電泳圖中陽性孔有且只有1條明亮的條帶，陰性對照未出現(xiàn)條帶；熔解曲線均為單峰，表明設(shè)計(jì)的引物特異性好，可以用于目的基因的定量檢測。

圖1 mcr-4/5/8引物特異性驗(yàn)證和熔解曲線Fig.1 Specificity verification of primers and melting curves for mcr-4/5/8M：DNA maker 2 000；A、B、C：mcr-4/5/8；1、2、3、4、5、8：mcr-1/2/3/4/5/8模板；-：陰性對照M：DNA maker 2 000；A，B，C：mcr-4/5/8；1,2,3,4,5,8：mcr-1/2/3/4/5/8 templates；-：Negative control

2.2 重組質(zhì)粒驗(yàn)證 將轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞的重組質(zhì)粒通過藍(lán)白斑篩選的方式，最終成功篩選出白色菌落(轉(zhuǎn)化子)。使用所設(shè)計(jì)的特異性引物以及pMD-19T載體引物M13對獲得的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行驗(yàn)證，確定重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功。通過mcr-4/5/8引物擴(kuò)增重組質(zhì)粒產(chǎn)生的目的片段預(yù)期大小為184、184 bp和170 bp；M13引物的擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)期長度為314、314 bp和300 bp。如圖2所示，片段大小與預(yù)期結(jié)果相一致，說明目的基因和T載體成功連接在一起，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 重組質(zhì)粒驗(yàn)證Fig.2 Verification for recombinant plasmidsA：M13引物擴(kuò)增；B：mcr-4/5/8引物擴(kuò)增；M：DNA marker 2 000；4、5、8：mcr-4/5/8重組質(zhì)粒；-：陰性對照A：M13 primer amplification；B：mcr-4/5/8 primers amplification；M：DNA marker 2 000；4,5,8：Recombinant plasmids of mcr-4/5/8；-：Negative control

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建 使用上述所制備的重組質(zhì)粒構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品，10倍梯度稀釋后構(gòu)建檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線，每個(gè)梯度3個(gè)平行。由表2可知：標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增效率接近100%，R2>0.999。從中插彩版圖3可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好；擴(kuò)增曲線平滑且平行性良好；熔解曲線Tm呈單峰，反應(yīng)過程中擴(kuò)增產(chǎn)物單一。結(jié)果表明本次試驗(yàn)所建立的檢測方法特異性好，可用于實(shí)際樣本中多黏菌素耐藥基因mcr-4/5/8的檢測。

表2 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)數(shù)據(jù)Table 2 Relevant data of real time PCR standard curve

圖3 mcr-4/5/8熒光定量檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線、擴(kuò)增曲線和熔解曲線Fig.3 Real-time PCR standard curves,amplification curves and melting curves for mcr-4/5/8A：標(biāo)準(zhǔn)曲線；B：擴(kuò)增曲線；C：熔解曲線A：Standard curves；B：Amplification curves；C：Melting curves

2.4 方法特異性和靈敏度的驗(yàn)證 對24份環(huán)境樣品進(jìn)行檢測，但樣本中mcr-4/5/8的檢測結(jié)果均為陰性，這可能跟mcr-4/5/8基因在國內(nèi)的流行特征有關(guān)。

同時(shí)利用所建立的方法對1株mcr-4陽性模板、1株mcr-5陽性模板、5株mcr-8陽性菌液以及3株mcr-8陰性菌液進(jìn)行盲選，即分別使用所設(shè)計(jì)的mcr-4/5/8特異性引物對這些模板和菌液進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，檢測結(jié)果見圖4，與之前的測序結(jié)果100%相一致，證明本次所構(gòu)建方法特異性好。

圖4 菌液中mcr-4/5/8基因的檢測Fig.4 Detection of mcr-4/5/8 genes in bacteria4-N/4-P：mcr-4陰性/陽性樣本；5-N/5-P：mcr-5陰性/陽性樣本；8-N/8-P：mcr-8陰性/陽性樣本4-N/4-P:mcr-4 negative/positive samples;5-N/5-P:mcr-5 negative/positive samples;8-N/8-P:mcr-8 negative/positive samples

3 討論

本試驗(yàn)采用了一種新型的PCR方法——實(shí)時(shí)熒光定量PCR，即通過向反應(yīng)體系中加入一定量的SYBR熒光基團(tuán)，使反應(yīng)體系隨著基因的擴(kuò)增增加熒光信號(hào)的強(qiáng)度[5]。SYBR熒光基團(tuán)可以與DNA雙鏈進(jìn)行特異性結(jié)合。只有與DNA雙鏈特異性結(jié)合的熒光染料才可以發(fā)射出熒光信號(hào)，因此，熒光信號(hào)的增加和目的基因的增加在整個(gè)過程中是完全一致的，由此可實(shí)現(xiàn)樣本的定量檢測[6]。相對于傳統(tǒng)PCR來說，具有方便、快捷、準(zhǔn)確等優(yōu)勢[5]。該方法目前應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，如臨床疾病診斷、動(dòng)物疾病檢測、食品安全、科學(xué)研究以及相關(guān)行業(yè)，運(yùn)用范圍廣泛。

隨著多重耐藥革蘭陰性菌的廣泛增多，多黏菌素在臨床上的使用日益增加。2015 年，多黏菌素耐藥基因mcr-1 在我國首次被報(bào)道[7]。2016年，在芬蘭發(fā)現(xiàn)了人類臨床上首株攜帶mcr-1 基因的多黏菌素耐藥菌[8]。隨后，mcr基因的各個(gè)變異體開始相繼出現(xiàn)(表3)，引起了全世界的廣泛關(guān)注。多黏菌素耐藥基因的出現(xiàn)給人類一個(gè)嚴(yán)重的警告。因此，構(gòu)建多黏菌素耐藥基因的快速篩選方法十分必要。目前，Li等已經(jīng)構(gòu)建了針對mcr-1/2/3的多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，可以從臨床和環(huán)境樣本中快速且有效地檢測出耐藥基因[9]。Rebelo等開發(fā)了一種用于檢測mcr-1/2/3/4/5的多重PCR方法，可以單獨(dú)或組合用于腸桿菌科細(xì)菌中的可轉(zhuǎn)移的多黏菌素抗性基因的檢測[10]。最近，有一篇關(guān)于mcr-8基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的報(bào)道，該方法可以從臨床樣本中準(zhǔn)確、高效地檢測出耐藥基因[11]。隨著多種mcr變體的出現(xiàn)和流行，從不同樣品中篩選耐藥基因mcr-4/5/8也是十分有必要的。本試驗(yàn)首次構(gòu)建了針對這3種多黏菌素耐藥基因的多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，不僅可以在培養(yǎng)的細(xì)菌中，還可以直接從糞便和土壤樣本中耐藥基因mcr-4/5/8進(jìn)行篩選。試驗(yàn)結(jié)果表明，本試驗(yàn)建立的熒光定量檢測方法具有非常高的靈敏度，其中，mcr-4/5/8的檢測限分別為3.4×100～7.9×108、1.4×101～1.0×109、2.9×101～2.4×108拷貝/μL，檢測靈敏度最低可以達(dá)到3.4個(gè)質(zhì)?？截悢?shù)。本次試驗(yàn)未能在環(huán)境樣本中檢測出耐藥基因mcr-4/5/8，較難評(píng)估m(xù)cr-4/5/8在畜禽養(yǎng)殖場中的流行情況，這可能與有限的環(huán)境樣本數(shù)量有關(guān)，也可能與這3種基因在全國范圍內(nèi)的流行特點(diǎn)有關(guān)。但是，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)數(shù)據(jù)以及陽性菌株的驗(yàn)證結(jié)果，已經(jīng)充分證明了本試驗(yàn)所建立方法具有高度的重復(fù)性和特異性。

表3 mcr-1及其各變體Table 3 mcr-1 and its variants

mcr-1是國際上首次發(fā)現(xiàn)的由質(zhì)粒介導(dǎo)的多黏菌素耐藥基因，該基因的出現(xiàn)加速了多黏菌素耐藥性在細(xì)菌之間的傳播。多黏菌素是目前治療多重耐藥革蘭陰性菌的最后手段，mcr-1及其變體的出現(xiàn)和廣泛流行給臨床治療感染性疾病造成了嚴(yán)重的威脅。本試驗(yàn)建立了針對耐藥基因mcr-4/5/8的快速檢測方法，能夠更好更快地從臨床和環(huán)境樣本中篩選出這3種耐藥基因，為畜牧生產(chǎn)和臨床上控制此類耐藥細(xì)菌傳播和相關(guān)耐藥性研究提供一定的幫助。

總之，本試驗(yàn)所構(gòu)建的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，能夠快速、特異、靈敏地檢測出菌液、糞便以及土壤樣本中的mcr-4、mcr-5或mcr-8基因，且該方法適用于任何具有熒光定量PCR儀的實(shí)驗(yàn)室，方便快捷、容易操作，可用于評(píng)估人類和動(dòng)物中該藥物抗性的流行程度[9]。