史喜菊，賴平安，張 偉，張紅梅，劉全國(guó)，柏亞鐸，徐立偉，種 焱

(1.中國(guó)海關(guān)科學(xué)技術(shù)研究中心,北京 朝陽(yáng) 100026;2.北京海關(guān)，北京 朝陽(yáng) 100026)

近些年我國(guó)對(duì)于活動(dòng)物的進(jìn)口需求逐年遞增，每年種豬進(jìn)口數(shù)量都超過(guò)2萬(wàn)頭，供港、澳活豬數(shù)量也非常巨大。對(duì)于這些出入境的動(dòng)物每頭都要進(jìn)行檢疫，目前主要的豬病檢疫對(duì)象都是對(duì)養(yǎng)殖業(yè)危害巨大、世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)重點(diǎn)關(guān)注、世界各國(guó)重點(diǎn)防控的疫病。但目前的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和方法基本上都是針對(duì)某種病原的單一檢測(cè)，針對(duì)不同的檢疫條款，往往需要逐個(gè)檢測(cè)不同病原。如果條款中沒有規(guī)定檢測(cè)某種疾病，但事實(shí)上動(dòng)物可能已經(jīng)感染了，就會(huì)造成漏檢。而且，進(jìn)境動(dòng)物經(jīng)過(guò)長(zhǎng)途運(yùn)輸后，在隔離檢疫期間可能會(huì)出現(xiàn)一些臨床疾病，很多病原都可以引起相似的臨床癥狀，現(xiàn)有單一檢測(cè)技術(shù)難以全面、真實(shí)地反應(yīng)畜禽感染狀態(tài)和發(fā)病死亡原因[1-2]。因此，本研究選擇了臨床上經(jīng)?；旌细腥居蛛y以鑒別診斷的偽狂犬病病毒(Porcine pseudorabies virus，PRV)、豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus，PPV)和豬圓環(huán)病毒2(Porcine circovirus type 2，PCV-2)[3-6]，建立了可用于這3種病毒混合感染檢測(cè)和鑒別診斷的多重?zé)晒釶CR方法，以實(shí)現(xiàn)多種病原同步檢測(cè)、快速靈敏地篩查“未知”病原并對(duì)混合感染進(jìn)行鑒別診斷的目的。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 偽狂犬病病毒(PRV)、豬細(xì)小病毒(PPV)和豬圓環(huán)病毒2(PCV-2)，均由本實(shí)驗(yàn)室收集、保存；質(zhì)控對(duì)照品及其他用于特異性測(cè)試的病毒對(duì)照品，均為本實(shí)驗(yàn)室制備的體外重組質(zhì)粒。

1.2 試劑 IQ Powermix PCR是BioRad公司產(chǎn)品；病毒總核酸提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；探針、引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 多重?zé)晒釶CR反應(yīng)引物和探針設(shè)計(jì) 根據(jù)PRV、PPV和PCV-2的基因序列特點(diǎn)，通過(guò)CLCMain Workbench 7.0.3和BioEditor 1.6.1軟件進(jìn)行了多重比較，分別選取了最為保守的基因片段gE基因、NS1基因和ORF2基因作為擴(kuò)增靶基因，根據(jù)多重?zé)晒釶CR引物、探針設(shè)計(jì)原則[1,7-8]以及后續(xù)標(biāo)準(zhǔn)化反應(yīng)體系和程序要求，利用Primer 3.0設(shè)計(jì)了引物和探針，所有引物和探針序列均經(jīng)過(guò)二級(jí)結(jié)構(gòu)和二聚體以及錯(cuò)配和交叉反應(yīng)性檢驗(yàn)[1,9-12]，其序列如表1所示。引物和探針用滅菌水稀釋成100 mmol/L儲(chǔ)藏液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 PRV、PPV和PCV-2一步法多重?zé)晒釶CR檢測(cè)引物和探針Table 1 Primers and probes of one-step multiplex real-time PCR for PRV,PPV and PCV-2

1.3.2 陽(yáng)性質(zhì)控品的制備 按照常規(guī)方法[1,13]，分別擴(kuò)增PRV的gE基因片段(2 745 bp)、PPV的NS1基因片段(500 bp)和PCV-2的ORF2基因片段(666 bp)，并克隆于pGEM-Teasy載體，經(jīng)PCR和酶切鑒定，分別獲得陽(yáng)性重組質(zhì)粒PRV-gE-DNA、PPV-NS1-DNA和PCV2-ORF2-DNA，經(jīng)測(cè)序確認(rèn)后測(cè)定其OD260值和OD280值，按照質(zhì)?？截悢?shù)(copies/μL)=(6.02×1023)×(ng/μL×10-9)/質(zhì)粒大小(bp)×660計(jì)算質(zhì)粒濃度，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 多重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系的建立 將引物和探針儲(chǔ)備液進(jìn)行10倍梯度稀釋，將引物進(jìn)行充分混合，配制成引物混合物終濃度為400 nmol/L，探針終濃度為200 nmol/L，反應(yīng)混合液包括2×IQ Powermix PCR緩沖液10 μL、引物混合物0.8 μL、PRV探針0.4 μL、PPV探針0.2 μL、PCV-2探針0.2 μL，模板DNA 1～5 μL，DEPC處理水補(bǔ)齊至總反應(yīng)體積20 μL。將混合液充分混合后，最后加入模板，按照95 ℃、5 min；95 ℃、15 s，60 ℃、45 s，44個(gè)循環(huán)的反應(yīng)程序進(jìn)行一步法熒光PCR反應(yīng)，所用設(shè)備為BioRad公司的CFX-96。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制和最低檢測(cè)限確定 分別將PRV、PPV和PCV-2質(zhì)控品進(jìn)行10倍梯度稀釋后進(jìn)行熒光PCR，用模板濃度-熒光Ct值做濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，最高稀釋倍數(shù)能檢測(cè)出的Ct值所對(duì)應(yīng)的濃度即為最低檢測(cè)限。

再將PRV、PPV和PCV-2質(zhì)控品等量混合后，進(jìn)行10倍梯度稀釋，進(jìn)行多重?zé)晒釶CR，用模板濃度-熒光Ct值做濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，最高稀釋倍數(shù)能檢測(cè)出的Ct值所對(duì)應(yīng)的濃度即為最低檢測(cè)限。

1.3.5 特異性試驗(yàn) 選擇了實(shí)驗(yàn)室制備的豬流感病毒(SIV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)、偽狂犬病病毒(PRV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、口蹄疫病毒(FMDV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)共9種豬病毒質(zhì)控品，分別用PRV、PPV和PCV-2的引物和探針進(jìn)行了單一熒光PCR，驗(yàn)證引物和探針的特異性。

用建立的多重?zé)晒釶CR對(duì)上述9種病毒質(zhì)控品進(jìn)行了檢測(cè)，驗(yàn)證引物和探針混合后多重反應(yīng)體系的特異性。

1.3.6 多重?zé)晒釶CR和單一熒光PCR的比較 將PRV、PPV和PCV-2質(zhì)控品等量混合后進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別進(jìn)行多重?zé)晒釶CR和PRV、PPV和PCV-2單一熒光PCR，將相同模板濃度對(duì)應(yīng)的熒光Ct值進(jìn)行比較，求解回歸方程，比較多重?zé)晒釶CR和各單一熒光PCR的符合性。

1.3.7 臨床樣品測(cè)試 對(duì)實(shí)驗(yàn)室收集的已知PRV陽(yáng)性組織樣品31份、PPV陽(yáng)性組織樣品52份、PCV-2陽(yáng)性組織樣品49份以及陰性樣品122份，用病毒基因組總核酸提取試劑盒(TIANamp Virus DNA/RNA Kit)按照說(shuō)明書要求提取總核酸，用建立的多重?zé)晒釶CR進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)行臨床樣品驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 陽(yáng)性質(zhì)控品的定量 將制備好的陽(yáng)性質(zhì)控品，分別用紫外分光儀測(cè)定其260 nm和280 nm的吸光度值并計(jì)算出質(zhì)?？截悢?shù)，結(jié)果見表2。

表2 陽(yáng)性質(zhì)控品DNA純度及含量測(cè)定Table 2 DNA purity and quantity of positive control plasmids

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制和最低檢測(cè)限確定 分別用PRV、PPV和PCV-2質(zhì)控品做濃度-Ct值標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。從圖1可以看出，標(biāo)準(zhǔn)曲線PCR擴(kuò)增效率E值、R2和曲線斜率均在正常范圍內(nèi)，說(shuō)明擴(kuò)增效率良好。將模板進(jìn)行1011倍稀釋仍能檢測(cè)到熒光信號(hào)，根據(jù)表2計(jì)算出對(duì)應(yīng)的最低檢測(cè)限在3.51～8.99 拷貝/μL。

圖1 單一熒光PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curves of single real-time PCRA:PRV；B:PPV；C:PCV-2

PRV、PPV和PCV-2混合質(zhì)控品做多重?zé)晒釶CR濃度-Ct值標(biāo)準(zhǔn)曲線，如封二彩版圖2。從中可以看出，各個(gè)多重?zé)晒鈪?shù)E值、R2和曲線斜率均在正常范圍內(nèi)，說(shuō)明擴(kuò)增效率并沒有多重混合受到干擾。最高稀釋倍數(shù)檢出限跟單一熒光PCR沒有明顯差異，均可達(dá)到10拷貝/μL以下。

圖2 PRV、PPV和PCV-2多重?zé)晒釶CR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of multiplex real-time PCR of PRV,PPV and PCV-2

2.3 特異性檢測(cè) 結(jié)果表明，每種病毒的引物和探針均只能擴(kuò)增出各自的病毒核酸，其他病毒模板的擴(kuò)增均為陰性，表明所設(shè)計(jì)的引物和探針特異性良好。利用建立的多重?zé)晒釶CR方法對(duì)1.3.5中的病毒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果PRV、PPV和PCV-2有擴(kuò)增曲線，其他病毒均無(wú)特異性擴(kuò)增信號(hào)，表明所建立的方法特異性良好，結(jié)果見表3。

2.4 多重?zé)晒釶CR和單一熒光PCR的比較 利用相同模板對(duì)多重?zé)晒釶CR和單一熒光PCR的符合性測(cè)試結(jié)果表明，PRV、PPV和PCV-2單一熒光PCR與多重?zé)晒釶CR的相關(guān)性系數(shù)R2分別為0.999 9、0.998 7和0.998 4，說(shuō)明多重?zé)晒釶CR和各單一熒光PCR的符合性良好，多重?zé)晒釶CR并沒有產(chǎn)生相互干擾，擴(kuò)增效率沒受影響，結(jié)果見封二彩版圖3。

圖3 多重?zé)晒釶CR與各單一熒光PCR的比較Fig.3 Comparasion between multiplex real-time PCR and the singular real-time PCRsA：多重?zé)晒釶CR與PRV單一熒光PCR的比較；B：多重?zé)晒釶CR與PPV單一熒光PCR的比較；C：多重?zé)晒釶CR與PCV-2單一熒光PCR的比較A:Comparasion between multiplex real-time PCR and PRV singular real-time PCR；B:Comparasion between multiplex real-time PCR and PPV singular real-time PCR；C:Comparasion between multiplex real-time PCR and PCV-2 singular real-time PCR

2.5 臨床樣品測(cè)試 用本研究建立的多重?zé)晒釶CR對(duì)已知的31份PRV陽(yáng)性樣品、52份PPV陽(yáng)性樣品和49份PCV-2陽(yáng)性樣品及122份陰性樣品進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果均與樣品已知狀態(tài)一致。不同的是，由于這些已知樣品原來(lái)只做了單目標(biāo)病原檢測(cè)，其他病毒感染情況未知，但是通過(guò)本研究建立的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在共計(jì)132份陽(yáng)性樣品中，有15份呈PRV和PPV雙陽(yáng)性(15/132)，有29份呈PPV和PCV-2雙陽(yáng)性(29/132)，有14份呈PRV和PCV-2雙陽(yáng)性(14/132)，有9份呈PRV、PPV和PCV-2三重陽(yáng)性(9/132)，表明PRV、PPV和PCV-2混合感染現(xiàn)象比較多見，多重?zé)晒釶CR可以檢測(cè)到原來(lái)靠單一熒光PCR沒有進(jìn)行篩查的非目標(biāo)病原，檢出了混合感染，避免了漏檢。

3 討論

PRV、PPV和PCV-2均為DNA病毒，是引起豬多系統(tǒng)疾病的常見病原，經(jīng)?；旌细腥?，診斷和防治比較困難，是世界各國(guó)養(yǎng)豬場(chǎng)檢疫凈化的主要對(duì)象[1-5]。本研究針對(duì)目前單一病原檢測(cè)方法的不足，建立了PRV、PPV和PCV-2三種豬病毒一步法多重?zé)晒釶CR檢測(cè)和鑒別方法。

方法敏感性分析表明，本研究建立的多重?zé)晒釶CR方法最低檢測(cè)限可以達(dá)到10拷貝/μL以下，與各自病原單一熒光PCR相比，雖然略有降低，但沒有明顯差異，這與報(bào)道的熒光PCR技術(shù)的敏感性指標(biāo)一致[1,7,10]。

方法特異性分析表明，本研究建立的多重?zé)晒釶CR引物和探針特異性均為100%，3個(gè)病原的引物和探針混合后，特異性并沒有受到干擾。特別是PCV-2病毒變異比較大，為了最大限度地覆蓋所有分離毒株，設(shè)計(jì)了3條反向引物和2條探針，這些引物在后期單一和多重?cái)U(kuò)增中各項(xiàng)PCR參數(shù)均在正常范圍內(nèi)，擴(kuò)增效率良好。

多重?zé)晒釶CR與單一熒光PCR比較分析表明，對(duì)于同一濃度模板，多重?zé)晒釶CR分別與各自單一熒光PCR擴(kuò)增得到的Ct值相關(guān)性非常高，R2可達(dá)0.999，再次證明了引物和探針的混合并沒有互相干擾，沒有影響擴(kuò)增效率。據(jù)報(bào)道，三重?zé)晒釶CR可以達(dá)到與單一熒光PCR相等的指標(biāo)參數(shù)，但是四重以后敏感性和特異性均會(huì)受到不同程度的影響[7,10-11],本研究也曾嘗試加入第4種病原，四重?zé)晒釶CR標(biāo)準(zhǔn)曲線指標(biāo)參數(shù)很難都落在合理范圍內(nèi)(未公開發(fā)表)，說(shuō)明產(chǎn)生了干擾。

本研究建立的多重?zé)晒釶CR對(duì)已知陰陽(yáng)性樣品檢測(cè)結(jié)果與已知完全一致。不同的是，從這132份 陽(yáng)性樣品中檢測(cè)到PRV和PPV混合感染15份(15/132)，檢測(cè)到PRV和PCV-2混合感染14份(13/132)，PPV和PCV-2混合感染29份(29/132)，檢測(cè)到這3種病原混合感染9份(9/132)。出現(xiàn)差異的原因是這些樣品之前是單項(xiàng)病原檢測(cè)篩選出來(lái)的，并沒有對(duì)其他項(xiàng)目進(jìn)行檢測(cè)，而用多重?zé)晒釶CR檢測(cè)后，發(fā)現(xiàn)了已經(jīng)存在的二重和三重感染，表明這3種病原在臨床上混合感染比較常見，這在Cao等(2005年)和Lee等(2007年)的研究中也有過(guò)類似報(bào)道[3-4]。這正是建立此多重檢測(cè)方法的目的，實(shí)現(xiàn)一次采樣、一次分析，多種病原同步檢測(cè)，可以對(duì)混合感染的“未知病原”進(jìn)行同步篩查和鑒別。