連朋敬，吳韋灑，白江松，白 玉，牛小飛，李靜云，張子卉，喬 健

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193)

腸道內(nèi)鈣離子的主動(dòng)吸收主要由瞬時(shí)受體電位通道蛋白6(Transient receptor potential channel type 6，TRPV6)完成[1]。TRPV6屬于瞬時(shí)感受器電位蛋白超家族，是Ca2+選擇性的離子通道，參與維持體內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)。鈣離子在小腸上皮細(xì)胞刷狀緣通過TRPV6的介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞，再由鈣結(jié)合蛋白(Calcium binding protein，CaBP)由細(xì)胞刷狀緣頂膜轉(zhuǎn)移到基底膜，完成鈣離子的吸收[2]。TRPV6在小腸上皮細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)受維生素D調(diào)節(jié)。維生素D通過結(jié)合細(xì)胞內(nèi)的維生素D受體(Vitamin D receptor，VDR)，調(diào)節(jié)TRPV6基因的轉(zhuǎn)錄[3]。因此，VDR和TRPV6與腸道內(nèi)鈣離子的吸收密切相關(guān)。鈣的缺失除了會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松外，還和高血壓、心臟病、糖尿病和癌癥等多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，特別是老年人，消化吸收能力弱，鈣的吸收率下降，而老年人正是季節(jié)性流感的易感人群。然而，流感感染是否會(huì)影響到腸道對鈣的吸收仍未可知。H9N2禽流感病毒是目前我國乃至世界范圍內(nèi)流行最廣的流感病毒之一，不僅可以在家禽中穩(wěn)定傳播，還可以感染哺乳動(dòng)物和人[4-6]。H9N2病毒主要侵犯呼吸系統(tǒng)，也可以造成腸道黏膜損傷[7]。本試驗(yàn)以滴鼻方法用H9N2病毒感染BALB/c小鼠，通過檢測小鼠小腸組織中VDR和TRPV6 mRNA表達(dá)變化，初步探討H9N2病毒感染和鈣離子代謝之間可能存在的關(guān)系，為以后的相關(guān)研究提供一些思路和參考。

1 材料與方法

1.1 H9N2病毒 本試驗(yàn)所用的H9N2病毒是2008年本實(shí)驗(yàn)室從河北一組患病雞群中分離獲得。經(jīng)過血凝血抑試驗(yàn)的鑒定，確定為H9N2亞型禽流感病毒，將其命名為 A/Chicken/Hebei/4/2008(H9N2)(GenBank 登錄號(hào)為 FJ499463-FJ499470)。經(jīng)實(shí)驗(yàn)室研究表明，該病毒為低致病性的禽流感病毒[8]。雞胚繁毒后測定病毒毒力，當(dāng)感染劑量為1×106TCID50時(shí)小鼠出現(xiàn)典型臨床癥狀，并且在此接種量下死亡率較低，便于觀察小鼠從感染發(fā)病到逐漸恢復(fù)的完整過程。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只5～6周齡、體重(20±2)g、雄性SPF級 BALB/c小鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.3 動(dòng)物感染及樣本采集 BALB/c小鼠隨機(jī)分組：H9N2感染試驗(yàn)組和無菌雞胚尿囊液對照組各30只。將H9N2病毒雞胚尿囊液用無菌生理鹽水稀釋到1×106TCID50，無菌尿囊液同等倍數(shù)稀釋。小鼠異氟烷吸入麻醉后，試驗(yàn)組和對照組分別滴鼻接種稀釋后的H9N2病毒雞胚尿囊液和無菌尿囊液，100 μL/只。每天在固定時(shí)間點(diǎn)觀察小鼠臨床癥狀，包括體溫、體重及采食量、精神狀態(tài)和死亡情況。在H9N2病毒感染后的第3、7、14、21天和第28天 兩組各隨機(jī)取5只小鼠，稱重，麻醉后脫頸處死，采集肺臟并稱重。采集十二指腸，用無菌PBS清洗凈十二指腸后，迅速將組織凍存于液氮中。

1.4 絕對熒光定量PCR檢測 將組織在液氮中研磨成粉末狀，于TRIzol裂解液中裂解。用組織樣本基因組提取試劑盒(CWbio.Co.Ltd，Cat#CW2094)，按照試劑盒說明書從組織樣本中提取總RNA。采用瓊脂糖凝膠電泳和紫外吸收法測定RNA的質(zhì)量。使用Primer 3.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列見表1，引物由Invitrogen公司合成。使用Thermo Script RT-PCR試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)完畢后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢查擴(kuò)增結(jié)果，目的片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收。回收的PCR產(chǎn)物進(jìn)行TA連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，并進(jìn)行菌落PCR陽性克隆鑒定，無誤后，提取質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定，發(fā)現(xiàn)無任何突變，與目的基因序列一致，可作為絕對定量的標(biāo)準(zhǔn)品。用紫外分光光度計(jì)測定質(zhì)粒OD260值，運(yùn)用公式得到相應(yīng)拷貝數(shù)。換算公式為質(zhì)?？截悢?shù)(copies/μL)=質(zhì)粒濃度(ng/μL)×6.02×1023/(質(zhì)粒分子量×660)。將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋，每個(gè)梯度取2 μL做模板建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得出標(biāo)準(zhǔn)方程。將所有DNA樣品進(jìn)行Realtime PCR檢測，每個(gè)樣本做3個(gè)重復(fù)。VDR按以下程序進(jìn)行：95 ℃ 5 min；95 ℃ 5 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s，40個(gè)PCR循環(huán)。TRPV6按以下程序進(jìn)行：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 40 s，40個(gè)PCR循環(huán)。之后進(jìn)行熔解曲線步驟。

表1 PCR引物Table 1 PCR primer

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 以Ct值為縱坐標(biāo)，基因拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)，用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣本DNA檢測Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得出樣本DNA拷貝數(shù)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用SPSS 19.0軟件處理，并分析組間差異(當(dāng)P<0.05時(shí)，表示其在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上有顯著性差異)。再使用GraphPad Prism 7進(jìn)行圖表繪制。所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)都用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建VDR和TRPV6基因標(biāo)準(zhǔn)曲線 以VDR和TRPV6的特異性的引物分別進(jìn)行PCR反應(yīng)后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)特異性條帶位于103 bp和163 bp處，且產(chǎn)物單一，與預(yù)期大小一致，說明引物特異性強(qiáng)，可進(jìn)行下一步試驗(yàn)(圖1)。菌落PCR電泳鑒定結(jié)果條帶分別處于103 bp和163 bp，與預(yù)期的2個(gè)目的片段的大小一致，說明電泳檢測得到了目的片段，為陽性克隆(圖2)。

圖1 VDR(A)和TRPV6(B)基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The result of VDR(A)and TRPV6(B)gene amplification by PCR1:DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；2～3:目的基因片段；4：陰性對照1:DNA marker;2-3:Target gene segment;4:Negative control

圖2 陽性克隆菌落的PCR鑒定Fig.2 Identification of positive clone colony by PCR1:DNA 相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；2：VDR 目的片段；3～5：陰性對照；6：TRPV6目的片段1:DNA marker;2:VDR target segment;3-5:Negative control;6:TRPV6 target segment

構(gòu)建好的質(zhì)粒測序鑒定發(fā)現(xiàn)無任何突變，與目的基因序列一致。用紫外分光光度計(jì)測定質(zhì)粒OD260值，運(yùn)用公式得到相應(yīng)拷貝數(shù)。VDR質(zhì)粒拷貝數(shù)為1.02×1011拷貝/μL，TRPV6質(zhì)?？截悢?shù)為1.06×1010拷貝/μL。分別以這2種質(zhì)粒做標(biāo)準(zhǔn)曲線。由表2得VDR基因標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-3.810X+33.618，曲線回歸系數(shù)R2=0.999，說明VDR標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒在這幾個(gè)稀釋度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。由表3得TRPV6基因標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-3.212X+42.026，曲線回歸系數(shù)R2=0.99，說明TRPV6標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒在這幾個(gè)稀釋度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

表2 VDR基因標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)Table 2 Standard curve data of VDR gene standard

表3 TRPV6基因標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)Table 3 Standard curve data of TRPV6 gene standard

2.2 小鼠感染H9N2病毒臨床癥狀 小鼠通過滴鼻接種H9N2病毒后第3天出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，包括精神沉郁、扎堆明顯、被毛凌亂，體重從接種后第2天就已出現(xiàn)下降(圖3A)，采食減少。接種后4～8 d，小鼠臨床癥狀最為嚴(yán)重，基本不采食、消瘦、步態(tài)不穩(wěn)，個(gè)別小鼠出現(xiàn)失明、弓背呼吸。感染后第8天，小鼠逐漸恢復(fù)采食，體重普遍開始增加，其他癥狀也逐漸減輕；到感染后第14天，小鼠癥狀基本恢復(fù)正常，但體重仍較對照組低(P<0.05)。與試驗(yàn)組相比，對照組的小鼠并未表現(xiàn)出異常癥狀。

肺系數(shù)是肺濕重與體重的百分比，是反應(yīng)肺水腫程度最重要的指標(biāo)之一。如圖3B所示，與對照組相比，試驗(yàn)組小鼠的肺系數(shù)在感染后第3天較對照組顯著升高(P<0.05)，第7天時(shí)最為嚴(yán)重，較對照組小鼠的肺系數(shù)高3倍左右(P<0.01)，到第14天 仍未恢復(fù)到正常水平，較對照組差異顯著(P<0.05)，表明H9N2病毒感染會(huì)引起小鼠出現(xiàn)明顯的肺水腫。

圖3 H9N2病毒感染后小鼠體重(A)和肺系數(shù)(B)的變化Fig.3 Changes in body weight(A)and lung index(B)of mice infected with H9N2 virus*：P<0.05；**：P<0.01

2.3 小鼠十二指腸組織中VDR和TRPV6 mRNA表達(dá)變化VDR基因樣本在實(shí)時(shí)熒光定量PCR后測得的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得到基因拷貝數(shù)，根據(jù)基因拷貝數(shù)作柱狀圖。從圖4A可以發(fā)現(xiàn)：在H9N2亞型禽流感病毒感染后，小鼠十二指腸中的VDR基因表達(dá)量與對照組小鼠相比較總體是下調(diào)的。感染后的第3天VDR基因表達(dá)量已經(jīng)出現(xiàn)顯著下降(P<0.05)，僅有對照組表達(dá)量的1/5，并一直持續(xù)到感染后第21天。即在感染后21 d內(nèi)，小鼠十二指腸內(nèi)VDR基因表達(dá)被顯著抑制。到感染后第28天 時(shí)，其基因表達(dá)量上升并顯著高于對照組(P<0.05)。從圖4B可以發(fā)現(xiàn)：H9N2病毒感染小鼠之后，小鼠十二指腸中TRPV6基因拷貝數(shù)的變化趨勢與VDR基因類似，總體是下調(diào)的。在感染后第3天，TRPV6基因表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)，但與對照組相比差異不顯著(P>0.05)；到第7天表達(dá)量達(dá)到最低值，僅為對照組表達(dá)量的1/2(P<0.05)；在第14天和第21天，表達(dá)量仍顯著低于對照組(P<0.05)；到感染后第28天時(shí)，TRPV6基因表達(dá)量基本恢復(fù)到正常水平(P>0.05)。

圖4 小鼠十二指腸組織中VDR(A)和TPPV6(B)mRNA表達(dá)變化Fig.4 Changes of VDR(A)and TRPV6(B)mRNA expression in mouse duodenum tissue與對照組比較，*：P<0.05Compared to control group,*:P<0.05

3 討論

有研究表明，H9N2禽流感病毒不經(jīng)過適應(yīng)就可以感染實(shí)驗(yàn)小鼠。本課題組用本實(shí)驗(yàn)所用的H9N2病毒毒株感染小鼠，小鼠出現(xiàn)了急性呼吸窘迫綜合征[9]。本試驗(yàn)用該毒株滴鼻感染小鼠情況基本相似。感染劑量為1×106TCID50時(shí)，小鼠沒有出現(xiàn)死亡情況，但癥狀非常明顯。小鼠感染后精神沉郁，被毛雜亂，扎堆，體重下降，肺系數(shù)顯著增加，說明肺組織出現(xiàn)明顯水腫、出血。小鼠第3天開始出現(xiàn)明顯癥狀，第7天最為嚴(yán)重，到第14天基本恢復(fù)，再現(xiàn)了從感染到發(fā)病再到痊愈的過程。

鈣離子的總體攝入量主要依賴于腸道吸收。腸道中TRPV6是Ca2+選擇性的離子通道，參與維持體內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)。TRPV6屬于維生素D依賴性蛋白。活化維生素D進(jìn)入細(xì)胞后和胞漿內(nèi)VDR結(jié)合，隨后VDR和類維甲酸受體X(RXR)形成二聚體，進(jìn)入細(xì)胞核，通過結(jié)合DNA上VDR反應(yīng)原件(VDREs)調(diào)控基因的表達(dá)[10]。TRPV6基因的啟動(dòng)子上有多個(gè)VDREs，即TRPV6的表達(dá)受VDR的調(diào)節(jié)。有研究表明，VDR基因敲除小鼠腸道中TRPV6表達(dá)要比野生型小鼠下降90%左右[11]，腸道鈣主動(dòng)吸收的水平不足正常水平的30%[12]。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H9N2病毒感染后，十二指腸中VDR和TRPV6基因表達(dá)均顯著降低，并且影響時(shí)間較長，從第3天一直持續(xù)到了第21天。小鼠感染H9N2病毒后的感染高峰期在第3～5天，在第5～7天發(fā)病最為嚴(yán)重，從第7天或第8天開始恢復(fù)，到第14天基本恢復(fù)。說明小鼠在感染期、發(fā)病期、恢復(fù)期十二指腸中VDR和TRPV6 mRNA表達(dá)均受到顯著抑制，有可能影響VDR和TRPV6蛋白的表達(dá)，進(jìn)而可能影響到十二指腸對鈣離子的吸收。

冬天光照時(shí)間短，皮膚合成的維生素D較少，因此機(jī)體內(nèi)維生素D水平較低，進(jìn)而影響鈣離子的吸收和代謝[13]。而冬天正是流感暴發(fā)的高峰期。在維生素D水平較低的情況下感染流感病毒，就可能嚴(yán)重影響到腸道鈣離子的吸收。特別是對于兒童和老年人來說，若他們不慎感染了流感病毒，從感染到痊愈甚至更長的一段時(shí)間鈣吸收發(fā)生障礙，可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的健康問題，如免疫力低下、心臟病發(fā)作等。目前，對鈣代謝影響因素的研究主要集中在飲食、激素、年齡和一些疾病，如高血壓、老年癡呆、糖尿病等，對于病毒感染影響腸道鈣離子的吸收報(bào)道很少見[14]。本試驗(yàn)初步探索了H9N2流感病毒感染對十二指腸鈣離子吸收的影響，希望對病毒感染和鈣代謝的關(guān)系起到一定的啟示作用。