杜津莉， 李 建， 孫 鵬， 王宇澄， 張潔瑛

(天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 天津 300381)

世界衛(wèi)生組織報(bào)告顯示，全球抑郁患者達(dá)3.5億人，每年自殺死亡的患者人數(shù)高達(dá)100萬人[1]。有研究表明，抑郁癥的發(fā)病機(jī)制與應(yīng)激密切相關(guān)[2-3]。海馬和前額葉皮質(zhì)等腦區(qū)長(zhǎng)期慢性應(yīng)激會(huì)造成關(guān)腦區(qū)的神經(jīng)元細(xì)胞受損和調(diào)亡，對(duì)認(rèn)知、感覺和運(yùn)動(dòng)等方面具有多級(jí)協(xié)調(diào)作用，是調(diào)控情緒的高級(jí)中樞。因此改善海馬和前額葉皮質(zhì)等腦區(qū)的神經(jīng)元損傷同時(shí)促進(jìn)其再生是治療抑郁癥的有效措施[4-5]。

腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)對(duì)腦神經(jīng)元細(xì)胞具有抗損傷和促生長(zhǎng)作用，該因子受細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-related kinases，ERK)調(diào)節(jié)[3]。推拿是一種很有效的放松身體的手段，對(duì)煩躁、焦慮、抑郁等情緒有良好的緩解作用[6]。抑郁癥發(fā)病機(jī)制的研究還處于探索之中，需要全面考慮，多層次綜合研巧，明確ERK-BDNF的生理病理變化規(guī)律和意義，可更好的闡述抑郁的病理機(jī)制，對(duì)抑郁的治療也有積極促進(jìn)的作用。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇從ERK信號(hào)通路這個(gè)點(diǎn)出發(fā)，研究推拿是否能激活慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠海馬和前額葉皮質(zhì)等腦組織的ERK信號(hào)通路，促進(jìn)BDNF表達(dá)，發(fā)揮抗抑郁的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)健康大鼠40只(北京華阜康動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，6～8周齡，體重為230～250 g。飼養(yǎng)動(dòng)物環(huán)境：室溫20～25℃，相對(duì)濕度40%～60%，飲水瓶每日更換，明暗環(huán)境各12 h交替。

1.2 主要儀器與試劑

曠場(chǎng)、高架十字迷宮及水迷宮的視頻采集及分析系統(tǒng)。ERK、P-ERK抗體(批號(hào)：4695S、4377S，Cell Signaling Technology公司)，BDNF抗體、GAPDH抗體(批號(hào)：ab46176、ab181602，美國(guó)Abcame公司)，鹽酸氟西汀分散片(禮來蘇州制藥有限公司，批號(hào)：4126A)，BDNF試劑盒(ZK-R3364，ZIKER子科生物)。

1.3 模型制備

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，制備慢性輕度不可預(yù)見性的應(yīng)激大鼠模型[1-2]。大鼠慢性應(yīng)激反應(yīng)造模21 d，每種應(yīng)激刺激不連續(xù)使用3次，包括：斷食24 h；斷水24 h；束縛4～6 h；振蕩30 min；夾尾30 min；冰水游泳(4～6℃，3～6 min)，夜間光照24 h。大鼠隨機(jī)分為4組(n=10)：空白對(duì)照組，造模21 d的模型組、氟西汀組(陽(yáng)性藥)、推拿組。空白組和模型組不做處理，氟西汀用蒸餾水配成0.2 ml/kg混懸液，以1.54 mg/kg灌胃給藥?？`成模大鼠于自制固定裝置，定位大鼠膀胱經(jīng)重要穴位：肺俞、心俞、膈俞、脾俞、腎俞、關(guān)元俞、申脈(圖1)，依標(biāo)準(zhǔn)按揉施推拿術(shù)；固定時(shí)間、每天 10 min，間隔2 min(共4次)，14 d連續(xù)施術(shù)。為確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，推拿手法由一人完成。

Fig. 1 Bladder meridian acupoint map of rats

1.4 標(biāo)本采集和處理

行為學(xué)評(píng)定結(jié)束后，5%水合氯醛麻醉，取大鼠腦前額葉皮質(zhì)組織于液氮中凍存。

1.5 行為學(xué)評(píng)定方法

1.5.1 曠場(chǎng)試驗(yàn)[7]場(chǎng)箱內(nèi)徑長(zhǎng)、寬、高為75 cm、75 cm、40 cm，外周帶有視頻錄像和照明的隔音箱、大鼠放置于場(chǎng)箱中央?yún)^(qū)域，錄像系統(tǒng)能自動(dòng)記錄大鼠在5 min內(nèi)的活動(dòng)路程。

1.5.2 糖水消耗實(shí)驗(yàn)[8-9]大鼠禁水23 h，鼠籠上同時(shí)放置事先稱重的兩瓶水分別為普通飲用水和1%蔗糖水。四組大鼠飲用1 h后，撤掉、稱重。

1.5.3 水迷宮實(shí)驗(yàn) 水迷宮為圓形水池，直徑100 cm，深50 cm，水溫(24±2)℃。水而覆一層塑料泡沫屑。池壁上4個(gè)等距離點(diǎn)分水池為4個(gè)象限，在第三象限中央放置平臺(tái)，平臺(tái)無色透明，直徑6 cm，高28 cm。平臺(tái)沒于水而下2 cm，水池周圍參照物保持不變。試驗(yàn)包括：(1)定位航行試驗(yàn)(place navigation test)：實(shí)驗(yàn)歷時(shí)7 d。將大鼠從入水面向池壁置入水槽中，記錄大鼠從入水到爬上平臺(tái)所需的時(shí)間，即逃避潛伏期。每只大鼠每人從4個(gè)不同象限入水點(diǎn)入水進(jìn)行訓(xùn)練各1次，取其平均值為其每人逃避潛伏期。訓(xùn)練中，若大鼠在60 s內(nèi)找到平臺(tái)，讓其于平臺(tái)上站立10 s；若未找到，用棒將其引上平臺(tái)，并讓其站立10 s，潛伏期限記為60 s。將大鼠從平臺(tái)上拿下來休息60 s之后，再按序由下一入水點(diǎn)入水進(jìn)行下一次實(shí)驗(yàn)。(2)空間探索試驗(yàn)第8天撤去平臺(tái)，將大鼠從第二象限入水點(diǎn)放入水槽，記錄60 s內(nèi)其在平臺(tái)象限的滯留時(shí)間。

1.6 指標(biāo)檢測(cè)

采用體質(zhì)量測(cè)量，Western blot法檢測(cè)前額葉皮質(zhì)ERK、P-ERK、BDNF蛋白表達(dá)情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的體質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果

與空白組比較，抑郁模型組大鼠體質(zhì)量下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表1)；與模型組比較，推拿組和氟西汀組組大鼠的體質(zhì)量均顯著增加(P<0.01)。

2.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

推拿14 d后，進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)顯示，與空白組比較，抑郁模型組大鼠水平運(yùn)動(dòng)總路程減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；與模型組比較，推拿組和氟西汀組大鼠的水平運(yùn)動(dòng)總路程均顯著增加(P<0.01, 表2)。

Tab. 2 Total distance of open field experiment inrats of each group(mm, n=10)

2.3 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

推拿14 d后，進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示(表3)，與空白組比，抑郁模型組穿越平臺(tái)次數(shù)、目標(biāo)象限路程及目標(biāo)象限停留時(shí)間均顯著減少(P<0.01)；與模型組比，推拿組和氟西汀組大鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)、目標(biāo)象限路程及目標(biāo)象限停留時(shí)間均有所增加(P< 0.05，P<0.01)。

Tab. 3 Experimental results of water maze space exploration inrats of each n=10)

2.4 大鼠糖水消耗量

實(shí)驗(yàn)前1 d，各組大鼠之間的糖水消耗量沒有顯著性差異(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)35 d后，與空白組相比，模型組糖水消耗顯著降低(P<0.01)。與模型組相比，推拿組、氟西汀組糖水消耗量顯著上升(P< 0.01，表4)。

Tab. 4 Sugar water consumption of rats before and after the experiment(g, n=10)

2.5 Western blot法檢測(cè)前額葉皮質(zhì)ERK、P-ERK、BDNF蛋白表達(dá)情況

推拿14 d后，大鼠前額葉皮質(zhì)ERK、P-ERK、BDNF蛋白檢測(cè)結(jié)果，如圖2和表5所示，空白組、模型組、西氟汀組、推拿組大鼠前額葉皮質(zhì)ERK蛋白表達(dá)無明顯差異。與空白組比較，抑郁模型組大鼠前額葉皮質(zhì)P-ERK和BDNF蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.01)；與模型組比較，推拿組和陽(yáng)性藥組前額葉皮質(zhì)P-ERK和BDNF蛋白表達(dá)顯著上升(P< 0.05，P<0.01)。

Fig. 2 Expressions of ERK, p-ERK and BDNF in prefrontal cortex

Tab. 5 Results of Western blot analysis of p-ERK / ERK protein in rats of each n=10)

3 討論

抑郁癥屬中醫(yī)“郁證”范疇，主要因勞神過度、憂思郁結(jié)、氣機(jī)郁滯所致。治法以解郁、調(diào)神為主[10]。推拿可使患者放松而精神內(nèi)守，治療過程中，醫(yī)生與患者溝通，引導(dǎo)情緒，專一病所，使其經(jīng)氣暢達(dá)；另外推拿治療后，熱氣流通全身，肌腠疏解。穴位推拿以經(jīng)絡(luò)俞穴為基礎(chǔ)，通過神經(jīng)反射和經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)調(diào)節(jié)患者神經(jīng)及分泌系統(tǒng)，使其功能平衡，達(dá)到大腦放松、心理釋放、肌肉松弛的效果[11]。本文推拿所取的各穴位作用如下[11-12]：肺俞可解表宣肺、肅降肺氣；心俞穴可養(yǎng)血寧心、理氣止痛、通絡(luò)寬胸、改善睡眠；膈俞：養(yǎng)血和營(yíng)、理氣寬胸、活血通脈；關(guān)元俞：外散小腹內(nèi)部之熱；胃俞穴可理氣和胃、化濕消滯、益氣和中；腎俞穴可補(bǔ)腎益氣；申脈：補(bǔ)陽(yáng)益氣，疏導(dǎo)水濕，治療頭痛、癲狂癇證、失眠等癥。本實(shí)驗(yàn)以手法作用于膀胱經(jīng)第一側(cè)線背腧穴[12]，通一身之陽(yáng)氣，調(diào)暢氣機(jī)、調(diào)節(jié)五臟六腑功能，達(dá)到平衡陰陽(yáng)、交心腎、養(yǎng)心血、安神志的作用。

ERK信號(hào)通路是經(jīng)典的MAPK(mitogen-activated protein kinase)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，遵循三級(jí)酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)?；罨腅RK迅速進(jìn)入核內(nèi)，磷酸化核糖體S6激酶(SRK)，進(jìn)而促進(jìn)多種轉(zhuǎn)錄因子和核蛋白的表達(dá)。ERK的磷酸化是該通路重要的樞紐，促進(jìn)BDNF等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、調(diào)亡、生存。臨床試驗(yàn)[13-14]和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[15-17]顯示抑郁癥的發(fā)生發(fā)展與ERK信號(hào)通路關(guān)系密切。人患有抑郁癥后，其腦額葉皮質(zhì)組織中ERK信號(hào)通路受到抑制，相關(guān)因子得不到激活從而表達(dá)下降，導(dǎo)致患者欣快感下降，同時(shí)焦慮情緒增加。其原因是MEK1(ERK1/2上游激酶)的基因表達(dá)下調(diào)，會(huì)導(dǎo)致患者血清中的BDNF水平下降，病情加重，生活質(zhì)量下降[18-20]。BDNF對(duì)腦神經(jīng)元細(xì)胞具有抗損傷和促生長(zhǎng)的作用，在與情感調(diào)節(jié)有著關(guān)的海馬、前額葉皮質(zhì)等腦區(qū)中含量較高。推拿具有悠久的歷史和系統(tǒng)的中醫(yī)理論體系，是一種放松身體的有效手段。抑郁癥在病理上表現(xiàn)出焦慮，情緒低落，思維遲緩，意志活動(dòng)減退等癥狀。有例可證，將中醫(yī)按摩應(yīng)用到抑郁癥患者身上將有效緩解相關(guān)抑郁癥狀，調(diào)理氣血，舒緩情志，放松患者的身體。本研究針對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路方面提出推拿抗抑郁機(jī)制研究假設(shè)，驗(yàn)證推拿是否能通過調(diào)節(jié)ERK的磷酸化水平化及BDNF的蛋白表達(dá)發(fā)揮抗抑郁作用。

額葉是大腦活動(dòng)的高級(jí)執(zhí)行中樞，位于前中央溝前部，占大腦皮層的40%左右，主要包括：運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)、前運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)、前額葉皮質(zhì)(PFC)和額葉底內(nèi)側(cè)部分。PFC與多個(gè)感覺加工區(qū)都存在著往返的纖維聯(lián)系，同杏仁核、伏隅核等核團(tuán)一起構(gòu)成獎(jiǎng)賞中樞調(diào)節(jié)情緒，尤其對(duì)獲取快樂的能力有重要作用。PFC與注意力、長(zhǎng)時(shí)短時(shí)記憶、認(rèn)知功能障礙以及多種神經(jīng)心理疾病有關(guān)，當(dāng)其受損時(shí)，會(huì)導(dǎo)致焦慮、抑郁、言語(yǔ)障礙等疾病，為多位學(xué)者研究抑郁癥模型的重點(diǎn)部位[21]。因此，本研究選擇前額葉皮質(zhì)部位進(jìn)行研究。

抑郁癥是一種由多因素引起的以情緒低落為典型表現(xiàn)的情感障礙，是危害全人類的常見病、多發(fā)病，已成為全球性的主要精神衛(wèi)生問題。慢性應(yīng)激作用雖小但持久，慢性或持續(xù)的應(yīng)激使中樞系統(tǒng)損傷，可能導(dǎo)致能力和適應(yīng)水平的逐漸減低。慢性應(yīng)激是生活事件和抑郁癥之間的一個(gè)重要中介因素，無論是身體還是心理上的慢性應(yīng)激都會(huì)使人或動(dòng)物患上抑郁癥，而慢性應(yīng)激則會(huì)加重抑郁情緒和情緒障礙的患者的癥狀。抑郁癥的生物學(xué)涉及體內(nèi)多個(gè)系統(tǒng)，致病因素非常復(fù)雜。推拿的抗抑郁作用是多靶點(diǎn)、多層次的共同結(jié)果，可對(duì)神經(jīng)一免疫一內(nèi)分泌系統(tǒng)綜合調(diào)節(jié)，但是推拿治療抑郁癥的作用機(jī)制多局限于單方面的獨(dú)立研究，缺乏系統(tǒng)性與綜合性的研究。因此，需要全方位，更深層次的角度去研究治療途徑：將傳統(tǒng)的中醫(yī)治療方法與西醫(yī)西藥的方法結(jié)合起來，在提高臨床療效的基礎(chǔ)上，闡明機(jī)理進(jìn)而獲得新的醫(yī)學(xué)認(rèn)識(shí)的一種途徑。已有多位學(xué)者對(duì)推拿針刺等中醫(yī)治療手法結(jié)合西藥去治療抑郁癥患者，獲得很成功的研究成果[22-24]。本研究以大鼠為研究對(duì)象，建立抑郁模型。在接受21d慢性溫和應(yīng)激刺激后，治療14d，模型組大鼠糖水消耗量減少，表明慢性應(yīng)激破壞了大鼠的獎(jiǎng)賞機(jī)制，反應(yīng)敏感水平下降，出現(xiàn)快感缺失、興趣減少的癥狀。同時(shí)伴有體質(zhì)量、水平穿越格數(shù)、目標(biāo)象限路程、目標(biāo)象限停留時(shí)間顯著減少，表現(xiàn)出大鼠探充行為和自主活動(dòng)減弱，與抑郁癥患者伴有的食欲、體重減少以及思維遲緩、意志活動(dòng)減退等精神運(yùn)動(dòng)遲滯癥狀相似，以上大鼠行為均證明了大鼠處于抑郁狀態(tài)。氟西汀為臨床治療抑郁癥的常用藥，治療效果顯著，本研究通過推拿組與氟西汀組藥效學(xué)比較，證明推拿可有效治療慢性應(yīng)激產(chǎn)生的抑郁大鼠。根據(jù)對(duì)人的推拿手法推演到大鼠相對(duì)應(yīng)的經(jīng)絡(luò)進(jìn)行推拿，觀察抑郁大鼠的體脂量，水迷宮、糖水消耗、礦場(chǎng)等實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)推拿手法的有效，進(jìn)一步通過Western Blot方法研究其效應(yīng)機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，造模成功的大鼠體質(zhì)量明顯下降、探究行為明顯減少；同時(shí)前額葉皮質(zhì)組織中ERK蛋白磷酸化水平和BDNF蛋白表達(dá)顯著下降。而經(jīng)過推拿干預(yù)的大鼠體質(zhì)量和探究行為明顯增加，說明推拿可改善大鼠的抑郁情緒及活動(dòng)強(qiáng)度；推拿組ERK蛋白磷酸化水平和BDNF蛋白表達(dá)顯著增加，說明通過推拿大鼠膀胱經(jīng)可促進(jìn)前額葉皮質(zhì)ERK蛋白磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)腦組織中的效應(yīng)蛋白BDNF的表達(dá)，改善大鼠的抑郁癥狀，為推拿用于臨床治療抑郁癥患者提供理論依據(jù)。