吳禮循， 吳 翔

(1. 海口市婦幼保健院檢驗(yàn)科； 2. 海南省中醫(yī)院檢驗(yàn)科， ?？?570203)

肺纖維化(pulmonary fibrosis, PF)是一種慢性進(jìn)行性肺間質(zhì)性疾病，其病因不詳。近年來肺纖維化的發(fā)病率和病死率持續(xù)增高，大多數(shù)患者確診后的中位生存期約為3年[1]。在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞受損、肺成纖維細(xì)胞過度增殖并轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積，以及肺泡腔逐漸減少和肺組織結(jié)構(gòu)破壞，最終導(dǎo)致氣體交換障礙甚至發(fā)生呼吸衰竭[2]。目前肺纖維化的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，因此進(jìn)一步闡明肺纖維化的機(jī)制將為其治療提供新思路。

白介素-11(interleukin-11, IL-11)是近年來新發(fā)現(xiàn)的 IL-6 家族成員之一，具有極強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)功能。研究顯示IL-11可直接導(dǎo)致心臟和腎臟纖維化，抑制IL-11可以顯著減輕心肌纖維化程度[3]，且IL-11的拮抗劑IL-11Rα 嵌合蛋白(IL-11 Rα Fc)可以有效抑制Th17細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)[4]。有研究報道IL-11及其受體在小鼠肺纖維化肺組織中的表達(dá)明顯增加[5]；而敲除小鼠IL-11受體可減輕小鼠肺纖維化[6]，提示IL-11在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中可能扮演重要作用。但是，拮抗IL-11是否對肺纖維化具有治療作用尚未見報道。本研究旨在探討拮抗IL-11對博來霉素(bleomycin, BLM)誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性小鼠肺纖維化的影響及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物

健康雄性C57BL/6小鼠120只(18-22 g)，購自海南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。小鼠飼養(yǎng)于溫度22～24 ℃、濕度55%、晝夜12 h/12 h的環(huán)境內(nèi)。實(shí)驗(yàn)過程中所有小鼠的處理均符合科技部關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的規(guī)定。

1.2 主要試劑

注射用鹽酸博來霉素(日本化藥株式會社)；IL-11拮抗劑IL-11 Rα FC(R&D system)；HE 染色試劑盒(碧云天)；Masson 染色試劑(索萊寶)；Collagen I、Collagen III和α-SMA一抗(武漢三鷹)；抗兔二抗(武漢賽維爾)；羥脯氨酸檢測試劑盒(南京建成)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo)；SYBR Green試劑盒(Takara)；ECL發(fā)光顯色液(Millipore)；TGF-β1酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒(eBioscience)。

1.3 動物分組及處理

將120只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為正常對照組(Control組)、IL-11 Rα FC組、BLM組和BLM+IL-11 Rα FC組，每組30只。小鼠經(jīng)腹腔注射1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉后固定于鼠板；消毒頸部皮膚后，剪開頸正中皮膚，暴露氣管。BLM組和BLM+ IL-11拮抗劑組按1.5 mg/kg體重一次性注射BLM(溶于生理鹽水)50 μl，正常對照組和IL-11拮抗劑組注射生理鹽水50 μl，氣管注射后旋轉(zhuǎn)鼠板，使液體均勻分布，隨后縫合頸部皮膚。于造模當(dāng)天開始，IL-11 Rα FC組和BLM+IL-11 Rα FC組小鼠每間隔3 d尾靜脈給予IL-11 Rα FC(2.5 mg/kg)(每只約50 μl)，其余兩組小鼠注射生理鹽水。觀察各組小鼠生存狀態(tài)。最后于造模后第21日處死小鼠，收集肺組織進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.4 小鼠生存率測定

造模后每天記錄各組小鼠存活數(shù)量，計算各組小鼠的生存率。生存率(%)=BLM造模后存活動物數(shù)量/造模時動物數(shù)量×100%。

1.5 小鼠肺組織病理學(xué)檢測

造模后第21日，每組選取8只小鼠，取右上肺置于4%多聚甲醛中固定24 h。石蠟包埋后，行4 μm厚連續(xù)切片。經(jīng)蘇木精-伊紅(HE)染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠肺組織病理學(xué)改變。

1.6 小鼠肺組織Masson染色以及Ashcroft評分

取各組小鼠肺組織石蠟切片進(jìn)行Masson染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠肺組織中膠原沉積。肺纖維化程度可根據(jù)能有效評價組織膠原沉積的Ashcroft評分進(jìn)行半定量分析：0分：正常肺組織；1分：肺泡出現(xiàn)少量纖維增厚；3分：肺泡出現(xiàn)中度增厚，但未見明顯肺組織結(jié)構(gòu)的紊亂；5分：纖維成分進(jìn)一步增加，肺組織結(jié)構(gòu)破壞，常伴有小纖維灶形成；7分：肺組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，大量纖維灶形成，常見蜂窩狀肺；8分：完全纖維化病變；2、4、6分界于上下評分之間。每組選取6張切片進(jìn)行評分統(tǒng)計分析。

1.7 小鼠肺組織羥脯氨酸含量測定

稱取100 mg小鼠肺組織，加入1 ml生理鹽水進(jìn)行肺組織勻漿，勻漿液經(jīng)3 000 r/min離心10 min后，吸取上清液并嚴(yán)格按照試劑說明書檢測羥脯氨酸含量。

1.8 小鼠肺組織Collagen I、Collagen III和α-SMA mRNA表達(dá)檢測

使用Trizol法提取小鼠肺組織的RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進(jìn)行real-time PCR檢測CollagenI，CollagenIII和α-SMA基因的表達(dá)情況。引物序列：CollagenI：上游tggagatgatggggaagctg，下游atctcctttggcaccatcca；CollagenIII：上游cggctgagttttatgacggg，下游aaccaggttccactttgcac；α-SMA：上游gcacagcttctccttgatgtc，下游ccgagatctcaccgacct；β-actin：上游tctttgcagctccttcgttg，下游tccttctgacccattcccac。

1.9 小鼠肺組織Collagen I、Collagen III和α-SMA蛋白表達(dá)檢測

將肺組織稱重后加入適量的RIPA裂解液，使用組織勻漿器研磨后12 000 r/min離心20 min取上清液，采用BCA法檢測總蛋白濃度，并按1∶1加入上樣緩沖液100℃煮10 min。取30 μg總蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白和轉(zhuǎn)膜后，一抗孵育4℃過夜，次日二抗孵育1 h，隨后采用ECL發(fā)光試劑盒顯色，凝膠成像系統(tǒng)曝光。

1.10 小鼠肺組織TGF-β1含量檢測

稱取100 mg小鼠肺組織，加入1 ml生理鹽水進(jìn)行肺組織勻漿，勻漿液經(jīng)3 000 r/min離心10 min后，吸取上清液并嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書檢測TGF-β1含量。

1.11 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 IL-11拮抗劑對肺纖維化小鼠生存率的影響

正常對照組與IL-11拮抗劑組小鼠未出現(xiàn)死亡。與正常對照組相比，BLM組小鼠生存率顯著下降(P<0.01，圖1)；BLM+ IL-11拮抗劑組的生存率較BLM組明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)。

Fig. 1 Effect of IL-11 antagonist on the survival rate of BLM-treated mice (n=30)

2.2 IL-11拮抗劑對小鼠肺組織病理學(xué)形態(tài)的影響

正常對照組小鼠與IL-11拮抗劑組小鼠的肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡間隔薄；BLM組肺泡間隔明顯增厚，肺間質(zhì)纖維增生，形成多個纖維灶，壓縮肺泡，肺泡嚴(yán)重萎陷；而BLM+ IL-11拮抗劑組小鼠肺組織肺泡塌陷及肺間質(zhì)纖維增生均明顯減輕，肺組織結(jié)構(gòu)破壞程度亦明顯降低(圖2)。

2.3 各組小鼠肺組織膠原沉積

Masson染色結(jié)果顯示正常對照組小鼠與IL-11拮抗劑組小鼠肺組織僅在血管周圍和氣管周圍可見少量的膠原纖維；BLM組小鼠肺組織切片藍(lán)染區(qū)域明顯增加，而BLM+ IL-11拮抗劑組小鼠肺組織藍(lán)染區(qū)域明顯減少(圖3)。Ashcroft評分結(jié)果顯示，正常對照組與IL-11拮抗劑組小鼠Ashcroft評分小于1，而BLM組小鼠Ashcroft評分顯著高于正常對照組(P<0.01)，BLM+ IL-11拮抗劑組小鼠Ashcroft評分較BLM組顯著降低(P<0.05，表1)。與正常對照組相比，IL-11拮抗劑組小鼠肺組織中HYP含量未見改變(P>0.05)，但BLM組小鼠肺組織HYP含量顯著增加(P<0.01)；IL-11拮抗劑可顯著性降低BLM組小鼠肺組織HYP含量(P<0.05，表1)。

Fig. 2 Effect of IL-11 antagonist on the pathological changes of BLM-treated mice (×200)

Tab. 1 Ashcroft score and HYP content in the lungs of mice

2.4 各組小鼠肺組織中Collagen I、Collagen III和α-SMA mRNA表達(dá)變化

與正常對照組相比，BLM組小鼠肺組織CollagenI、CollagenIII和α-SMAmRNA表達(dá)均顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而BLM+ IL-11拮抗劑組小鼠肺組織CollagenI、CollagenIII和α-SMAmRNA表達(dá)較BLM組顯著降低(P<0.05，表2)。

Fig. 3 Effect of IL-11 antagonist on the Masson staining of BLM-treated mice (×200)

Tab. 2 Gene expressions of Collagen I, Collagen III, and α-SMA in the lungs of mice n=8)

2.5 各組小鼠肺組織Collagen I、Collagen III、α-SMA和TGF-β1蛋白表達(dá)變化

Western blot結(jié)果顯示，BLM組小鼠肺組織Collagen I、Collagen III和α-SMA蛋白表達(dá)顯著高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而BLM+ IL-11拮抗劑組小鼠肺組織Collagen I、Collagen III和α-SMA蛋白表達(dá)較BLM組顯著降低(P<0.05，圖4、表3)。ELISA結(jié)果顯示，BLM組小鼠肺組織中TGF-β1含量顯著高于正常對照組(P<0.01)，而BLM+ IL-11拮抗劑組小鼠肺組織中TGF-β1含量低于BLM組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表3)。

Fig. 4 Effects of IL-11 antagonist on protein expressions of Collagen I, Collagen III, and α-SMA detected by Western blot

Tab. 3 Protein expressions of Collagen I, Collagen III, α-SMA, and TGF-β1 in the lungs of mice n=8)

3 討論

BLM是誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性肺纖維化的常用藥物之一，其誘導(dǎo)的動物模型可表現(xiàn)出與臨床肺纖維化患者類似的特征，例如上皮細(xì)胞的受損、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化以及成纖維細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞細(xì)胞[7, 8]。BLM單次氣管注射的給藥方法在給藥后的第14日可以觀察到肺纖維化的病理改變，第21日肺纖維化的程度達(dá)到峰值[9, 10]。HE染色、Masson染色以及膠原沉積的結(jié)果提示本研究成功構(gòu)建肺纖維小鼠模型。

IL-11是在肺纖維化患者中的表達(dá)顯著增加，可能參與肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。本研究觀察到使用IL-11拮抗劑IL-11 Rα Fc可以明顯改善BLM誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠的生存率，減輕肺組織的病理學(xué)改變以及Masson染色所顯示的膠原沉積情況。膠原纖維沉積是肺纖維化重要的病理改變，其中Ⅰ、Ⅲ型膠原是其主要組分，常作為反映肺纖維化的指標(biāo)[11]，IL-11 Rα Fc可抑制BLM誘導(dǎo)的Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)的增加。已知羥脯氨酸在膠原蛋白中占 13.4%，在其他蛋白中幾乎不存在，故羥脯氨酸含量可作為定量反映膠原含量的指標(biāo)[12, 13]。IL-11 Rα Fc可減少BLM誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠肺組織中羥脯氨酸的含量。以上結(jié)果證實(shí)拮抗IL-11可減少BLM誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠肺組織的膠原沉積。

TGF-β1被認(rèn)為是肺纖維化發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵驅(qū)動因素之一[14, 15]，下調(diào)TGF-β1的表達(dá)是治療肺纖維化的潛在策略[16]。TGF-β1誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞是肺纖維化的重要特征[17]，肌成纖維細(xì)胞的關(guān)鍵表型標(biāo)志是α-SMA表達(dá)上調(diào)[18]，且肌成纖維細(xì)胞是I型膠原和纖維連接蛋白的異常沉積的主要來源。本研究結(jié)果顯示IL-11拮抗劑可抑制BLM誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠肺組織中α-SMA表達(dá)的上調(diào)，表明拮抗IL-11信號轉(zhuǎn)導(dǎo)能有效抑制肌成纖維細(xì)胞的增殖分化。因此，本研究結(jié)果顯示IL-11 Rα Fc可直接減少肺纖維化小鼠肺組織TGF-β1的含量，提示IL-11 Rα Fc可能通過抑制TGF-β1表達(dá)以及下游的細(xì)胞分子事件來減緩肺纖維化的疾病進(jìn)展。

綜上所述，本研究證實(shí)IL-11拮抗劑可減輕BLM誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化，可為臨床治療肺纖維化提供新思路。

利益沖突聲明： 作者聲稱無任何利益沖突。