王 品， 曹建民， 胡 戈， 周海濤， 張 靜， 郭 嫻， 牛衍龍， 程鑫云， 李嘉蓓

(1. 北京物資學院， 北京 101149； 2. 北京體育大學， 北京 100084； 3. 常州大學， 江蘇 常州 213164； 4. 北京聯(lián)合大學， 北京 100101；5. 北京聯(lián)合大學 生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點實驗室， 北京 100191； 6. 贛南醫(yī)學院， 江西 贛州 341000)

Toll-樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)作為炎癥反應(yīng)過程中重要上游啟動蛋白，廣泛表達于多種免疫細胞表面。當免疫細胞受到應(yīng)激刺激時，TLR4可以通過激活TLR4-p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)/核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信號通路，從基因水平誘導多種促炎細胞因子表達，引發(fā)炎癥反應(yīng)[1-2]。脾臟作為人體最大的免疫器官，是免疫應(yīng)答發(fā)生的重要基地，在細胞免疫和體液免疫中均發(fā)揮著不可替代的作用。長時程、大強度運動極易引發(fā)機體過度疲勞，當疲勞無法得到有效恢復時，機體可能發(fā)生過度訓練綜合癥。研究表明過度訓練不僅會影響運動能力，誘發(fā)運動性免疫抑制，還會引發(fā)運動性脾臟功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷，炎癥反應(yīng)是其中主要影響因素[3-4]。姜黃素是姜黃中提取的一種植物多酚，具有抗氧化、抗腫瘤、保護神經(jīng)等多種藥理學作用，亦可通過有效抑制TLR4-MAPK/NF-κB信號通路激活，減少腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)及白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)等促炎因子的表達，發(fā)揮抑炎作用[5]。本課題組前期研究[6]亦發(fā)現(xiàn)姜黃素可通過抑制炎癥，延緩長時程、大強度運動所致運動性臟器損傷，保護臟器結(jié)構(gòu)和功能正常。本實驗結(jié)合前期研究，通過觀察脾臟組織病理學改變，計算脾臟指數(shù)，結(jié)合脾臟組織相關(guān)信號通路蛋白表達水平及炎癥指標變化，探討姜黃素通過調(diào)控TLR4-p38 MAPK/NF-κB信號通路，緩解過度訓練所致大鼠脾臟炎癥反應(yīng)，保護脾臟的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

63只7周齡雄性Wistar大鼠，SPF級，體重(218.4±10.7)g，北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部提供，生產(chǎn)合格證編號：SCXK(京) 2016-0010。北京體育大學SPF級動物實驗室正常晝夜節(jié)律飼養(yǎng)，溫度(22±2)℃，相對濕度65%±10%。4 d適應(yīng)性飼養(yǎng)后，以20 min/d強度進行3 d適應(yīng)性游泳訓練，3只大鼠因無法完成訓練，剔除后將剩余大鼠隨機分為安靜對照組(C組，n=12)、過度訓練模型組(OM組，n=24)和姜黃素+模型組(COM組，n=24)。

1.2 訓練方案與干預

C組不進行運動干預。OM、COM組大鼠采用8周遞增負荷游泳訓練方案建立過度訓練動物模型，方案[7]見圖1。訓練過程中，若大鼠下沉不能自主上浮，計時10 s后迅速托出水面，休息5～10 min后繼續(xù)訓練直至完成訓練計劃。

姜黃素購自陜西源泰生物科技公司，純度≥99%，批號：17012571。使用0.5%羧甲基纖維素納作為助溶劑，配制姜黃素混懸液，4℃存放備用。根據(jù)文獻[6]及預實驗結(jié)果，COM組大鼠姜黃素干預劑量為200 mg/kg，灌胃體積為5 ml/kg；其他組灌胃等體積0.5 %羧甲基纖維素納助溶劑。訓練期間每日灌胃1次，在訓練前1 h進行。

Fig. 1 Swimming training program of rats

1.3 實驗動物取材

受訓練量、訓練強度、運動疲勞恢復等因素影響，大鼠在游泳訓練中易出現(xiàn)意外死亡現(xiàn)象。OM、COM組取材前分別剩余11只和14只大鼠。末次訓練結(jié)束后24 h，大鼠以乙醚麻醉后稱重，頸總動脈取血，4℃離心10 min，3 000 r/min，分離血清凍存待測血清NF-κB、TNF-α、IL-6、白細胞介素-10(interleukin-10，IL-10)濃度。取出脾臟后，小心剝離周圍脂肪組織，在經(jīng)過預冷的生理鹽水中洗凈血污，濾紙吸取多余液體后稱重、記錄并計算脾臟指數(shù)。切取1 cm×0.5 cm×0.2 cm脾臟組織浸入4%多聚甲醛常溫固定待后期蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色后光鏡下觀察脾臟組病理變化及檢測脾臟組織p38 MAPK、磷酸化p38 MAPK(phosphorylated p38 mitogen-activatecl protein kinase, p-p38 MAPK)和NF-κB蛋白質(zhì)表達情況；另取0.3 g左右脾臟組織，準確稱量重量后按照組織塊重量W(g)/勻漿介質(zhì)V(ml)為1/9的比例加入PBS緩沖液，在冰上充分研磨后進行超聲破碎，5 000 r/min離心5 min，取上清待測脾臟組織TNF-α、IL-6、IL-10濃度；另取部分脾臟放入PBS緩沖液中低溫保存，待測脾臟單核細胞表面TLR4表達率。

1.4 指標測試方法

按照試劑盒說明書對各指標進行測試和計算。主要儀器包括RM 2016病理切片機(德國Leica公司)，BX51F32H01光學顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，Pannoramic MIDI全自動數(shù)字切片掃描系統(tǒng)(匈牙利3D HISTECH公司)，Wellscan MK3酶標儀(芬蘭Thermo Labsystems公司)，CytoFLEX流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)，NR-B17CC超低溫冰箱(日本Panasonic公司)，DY89-Ⅱ電動玻璃勻漿機(寧波新芝生物科技股份有限公司)等。

1.4.1 脾臟指數(shù)計算[4]脾臟指數(shù)=脾臟重量(mg)/體重(g)×100%

1.4.2 脾臟病理變化評價 將固定好的脾臟組織取出，經(jīng)梯度酒精脫水后進行透明處理，浸蠟包埋，冷卻后以4 μm厚度進行切片。HE染色，400倍光鏡下觀察脾臟組織病理變化。

1.4.3 蛋白免疫組化分析 采用免疫組化法檢測脾臟p38 MAPK、p-p38 MAPK和NF-κB蛋白質(zhì)表達情況。石蠟切片經(jīng)梯度酒精脫蠟后進行抗原修復，加入3%過氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉后加入一抗，4 ℃孵育過夜，加入對應(yīng)二抗，室溫孵育后進行二氨基聯(lián)苯胺顯色，復染細胞核，脫水封片。采用數(shù)字切片掃描系統(tǒng)對整張切片進行全視野數(shù)字掃描，細胞核顏色為深棕色、棕黃色、淺黃色和藍色分別判定為強陽性、中度陽性、弱陽性和陰性。應(yīng)用公式計算H-score進行組間分析。H-score=(弱陽性細胞密度×1)+(中陽性細胞密度×2)+(強陽性細胞密度×3)?？贵w由美國Sigma公司提供。

1.4.4 其他指標測試方法 采用放射免疫法測定血清睪酮(testosterone，T)和皮質(zhì)酮(corticosterone，Cor)；采用流式細胞術(shù)檢測脾臟單核細胞表面TLR4表達率；酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清NF-κB、血清及脾臟組織TNF-α、IL-6、IL-10濃度。以上試劑盒由北京華英生物技術(shù)研究所提供。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清睪酮/皮質(zhì)酮及脾臟指數(shù)

血清T，與C組相比，OM組極顯著降低(P< 0.01)；與OM組相比，COM組極顯著升高(P< 0.01)。血清Cor，與C組相比，OM組極顯著升高(P<0.01)；與OM組相比，COM組極顯著降低(P<0.01)。組間T/Cor比值變化與T變化趨勢一致。脾臟指數(shù)，與C組相比，OM組極顯著降低(P< 0.01)；與OM組相比，COM組顯著升高(P<0.05，表1)。

2.2 各組大鼠脾臟組織形態(tài)

光鏡下觀察，大鼠脾臟組織病理學診斷結(jié)果顯示(圖2)，C組大鼠脾臟組織形態(tài)正常，被膜、小梁、白髓和紅髓結(jié)構(gòu)清晰，脾小體未見增大，生發(fā)中心明顯，脾竇內(nèi)壁光滑，未見充血和淋巴細胞。OM組大鼠脾臟組織形態(tài)明顯改變，紅髓和白髓交界處淋巴細胞數(shù)量增多，脾小體增大，出現(xiàn)多個生發(fā)中心，脾竇內(nèi)皮細胞腫脹，竇腔充血且可見淋巴細胞增多。

Tab. 1 Serum testosterone/corticosterone levels and spleen index in each group

COM組大鼠脾臟組織形態(tài)較OM組明顯改善，僅可見竇腔輕度充血及少量淋巴細胞分布。

Fig. 2 Spleen morphology in each group (HE ×400)

2.3 各組大鼠血清炎癥因子水平

血清促炎指標NF-κB、TNF-α和IL-6，與C組相比，OM組均極顯著升高(P<0.01)；與OM組相比，COM組均顯著降低(P<0.05)。血清抑炎指標IL-10，與C組相比，OM組極顯著降低(P<0.01)；與OM組相比，COM組顯著升高(P<0.05，表2)。

Tab. 2 Serum inflammatory cytokines level in each group (ng/L,

2.4 各組大鼠脾臟單核細胞TLR4表達率及炎癥因子水平

脾臟單核細胞TLR4表達率、TNF-α和IL-6，與C組相比，OM組均極顯著升高(P<0.01)；與OM組相比，COM組均顯著降低(P<0.05或P<0.01)。脾臟IL-10，與C組相比，OM組極顯著降低(P< 0.01)；與OM組相比，COM組極顯著升高(P< 0.01，表3)

Tab. 3 TLR4 expression rates on splenic monocyte surface and level of inflammatory cytokines in spleen in each group

2.5 各組大鼠脾臟p38 MAPK、p-p38 MAPK和NF-κB蛋白質(zhì)表達水平

脾臟組織p38 MAPK、p-p38 MAPK和NF-κB蛋白質(zhì)表達水平，與C組相比，OM組均顯著上調(diào)(P<0.05或P<0.01)；與OM組相比，COM組均顯著下調(diào)(P<0.05，表4，圖3)。

Tab. 4 H-score of p38 MAPK, p-p38 MAPK and NF-κB in spleen of each group

Fig. 3 The expressions of p38 MAPK, p-p38 MAPK and NF-κB in spleen in each group The color of nuclei was dark brown, brownish yellow, light yellow and blue, which were judged as strong positive, moderate positive, weak positive and negative, respectively

3 討論

脾臟作為最大的淋巴器官，在局部和全身免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要整合作用。同時脾臟也是血液循環(huán)系統(tǒng)主要的過濾器。過度訓練可破壞促炎/抑炎因子間的動態(tài)平衡，降低人體免疫防御活性，誘發(fā)脾臟功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷[3-4]。血清T/Cor比值在體育科學領(lǐng)域是判斷過度訓練的常用指標[8]。脾臟指數(shù)則可間接反映脾臟功能[4]。本研究中與C組相比，OM組大鼠血清T水平極顯著降低，Cor水平極顯著升高，T/Cor比值極顯著降低，同時脾臟指數(shù)出現(xiàn)極顯著降低，HE染色后光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)脾臟組織出現(xiàn)典型慢性炎癥病理變化，說明本研究通過8周遞增負荷游泳訓練，成功建立過度訓練動物模型，并引發(fā)脾臟結(jié)構(gòu)/功能異常。

TLR4-p38 MAPK/NF-κB信號通路與炎癥調(diào)節(jié)和控制機制密切相關(guān)。TLR4作為跨膜蛋白Toll樣受體家族的成員，其激活具有雙向作用。適度表達的TLR4可以啟動機體防御機制，在自身免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用；而過量運動誘發(fā)TLR4過度表達，又會成為炎癥性疾病發(fā)展的助推因素[9]。p38 MAPK通路可對多種應(yīng)激刺激產(chǎn)生廣泛應(yīng)答，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是多種炎癥疾病的治療靶點。TLR4[10]和運動應(yīng)激[11]均可通過增加p-p38 MAPK表達，誘導炎癥反應(yīng)。NF-κB在哺乳動物先天免疫反應(yīng)和慢性炎癥中發(fā)揮關(guān)鍵作用，也是TLR4誘導炎癥反應(yīng)的重要靶點。TLR4表達上調(diào)將促使NF-κB與NF-κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB，IκB)解離，轉(zhuǎn)位至胞核內(nèi)與DNA特定序列結(jié)合，調(diào)節(jié)炎癥因子基因轉(zhuǎn)錄，參與炎癥發(fā)展與轉(zhuǎn)歸等生理過程[1]。而活化的p38 MAPK也可通過磷酸化修飾或促進炎癥因子表達激活NF-κB，后者又能夠通過TNF-α、IL-6等炎性產(chǎn)物進一步激活p38 MAPK信號通路[12]。本研究中，與C組相比，OM組大鼠脾臟單核細胞表面TLR4表達率、p38 MAPK、p-p38 MAPK以及NF-κB蛋白質(zhì)表達水平均顯著升高，同時脾臟及血清促炎因子TNF-α、IL-6水平同步顯著升高，抑炎因子IL-10水平同步顯著降低。上述結(jié)果說明8周大強度游泳訓練激活TLR4-p38 MAPK/NF-κB信號通路，打破促炎/抑炎因子間的動態(tài)平衡，致使脾臟慢性炎癥反應(yīng)加劇，炎癥因子釋放入血，引發(fā)血清炎癥水平同步升高。

姜黃素是一種食源性多酚類化合物，具有多個功能基團，可與多種分子靶標結(jié)合，發(fā)揮抑炎作用[5]。姜黃素及其類似物可以與脂多糖競爭結(jié)合TLR4的共受體蛋白髓樣分化蛋白2，抑制兩者形成信號轉(zhuǎn)導復合物，減輕TLR4介導的炎癥過程[13]。p38 MAPK是姜黃素發(fā)揮抑炎作用的又一重要靶點。Guimar?es等[14]的研究中，利用大腸桿菌脂多糖建立大鼠巨噬細胞炎癥模型，發(fā)現(xiàn)姜黃素通過阻止p38 MAPK的磷酸化和核易位，抑制脂多糖誘導的TNF-α和IL-6表達。Song等[15]的研究也認為，姜黃素的抑炎作用可歸因于對p38 MAPK磷酸化的抑制。同時，姜黃素作為一種有效的NF-κB抑制劑，可以通過抑制IκB磷酸化、IκB激酶活性以及NF-κB核易位，直接發(fā)揮抑炎作用[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，COM組大鼠脾臟單核細胞表面TLR4表達率、p38 MAPK、p-p38 MAPK以及NF-κB蛋白質(zhì)表達水平較OM組均顯著降低，同時伴隨脾臟及血清促炎因子水平同步顯著降低，抑炎因子水平同步顯著升高，說明補充姜黃素可以改善TLR4-p38 MAPK/NF-κB通路介導的炎癥過程，調(diào)節(jié)相關(guān)炎癥因子的合成與分泌，這與相關(guān)研究結(jié)果基本一致[16-17]。炎癥反應(yīng)通常伴隨巨噬細胞向M1型極化，導致促炎因子過度表達，而姜黃素可以通過抑制巨噬細胞向M1型極化，增加M2型巨噬細胞數(shù)量，直接減少促炎因子基因表達，減輕炎癥反應(yīng)[18]。IL-10作為一種有效的抑炎因子，在抑制免疫反應(yīng)和預防過度炎癥反應(yīng)誘導的器官損害中發(fā)揮重要作用[19]。細胞實驗證實[20]，巨噬細胞攝取負載姜黃素的納米顆粒后顯著增加IL-10的釋放。Larmonier等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，在IL-10缺陷小鼠結(jié)腸炎模型中，姜黃素對NF-κB活性無顯著影響，這提示本研究中COM組大鼠脾臟及血清IL-10濃度均較OM組顯著升高，可能不僅是姜黃素發(fā)揮抑炎作用的結(jié)果，也是姜黃素發(fā)揮抑炎作用的中介途徑之一。上述結(jié)果結(jié)合COM組大鼠脾臟指數(shù)及組織病理學診斷結(jié)果的改善，充分說明在8周遞增負荷游泳訓練期間對大鼠進行一定劑量姜黃素干預，可以通過多靶點調(diào)控，有效恢復失衡的炎癥介質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，維護促炎/抑炎因子間的動態(tài)平衡，通過減輕過度炎癥反應(yīng)保護脾臟。

綜上所述，8周遞增負荷游泳訓練引發(fā)大鼠脾臟組織炎癥反應(yīng)加劇，出現(xiàn)炎癥病理變化。訓練期間補充姜黃素可以通過下調(diào)TLR4-p38 MAPK/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白質(zhì)表達，維護促炎/抑炎因子間的動態(tài)平衡，保護脾臟。本研究將為運動性炎癥反應(yīng)誘發(fā)臟器損傷提供實驗依據(jù)，相關(guān)信號轉(zhuǎn)導通路之間的交互作用有待進一步研究。