郜慧英 ， 周 艷 ， 高 潔 ， 李顏君 ， 孫向榮

(1. 菏澤醫(yī)學(xué)專(zhuān)科學(xué)校護(hù)理系， 山東 菏澤 274000； 2. 青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系， 山東 青島 266071)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是由多種病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝紊亂性疾病，已成為僅次于腫瘤、心腦血管疾病，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的世界第三大疾病[1]。糖尿病患者伴隨有嚴(yán)重的胃腸動(dòng)力紊亂，影響著患者的生活質(zhì)量。

下丘腦是腦內(nèi)調(diào)節(jié)能量代謝的中心，下丘腦腹內(nèi)側(cè)核(ventromedial hypothalamic nucleus，VMH)、下丘腦外側(cè)區(qū)(lateral hypothalamic area，LHA)、下丘腦室旁核(paraventricular nucleus，PVN)以及弓狀核(arcuate nucleus，ARC)都參與攝食的調(diào)控。海馬屬于邊緣系統(tǒng)[2]，可通過(guò)下丘腦和腦干的迷走神經(jīng)復(fù)合體、內(nèi)分泌系統(tǒng)和神經(jīng)遞質(zhì)等參與自主神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控。還有文獻(xiàn)報(bào)道，人的攝食欲望以及攝食行為與海馬活動(dòng)有著密切的關(guān)系[3]。由此看來(lái)，雖然下丘腦在能量平衡調(diào)控中扮有重要的角色，但它不是一個(gè)獨(dú)立的調(diào)控實(shí)體，其功能和作用還有賴(lài)于與其它中樞如海馬共同完成。

肥胖抑素(obestatin)是2005年發(fā)現(xiàn)的腦腸肽，可抑制攝食，減少體重[4]，并能拮抗饑餓素(ghrelin)引起的平滑肌收縮效應(yīng)[5]；在飽腹?fàn)顟B(tài)下，obestatin抑制胃竇和十二指腸的運(yùn)動(dòng)[6]，obestatin受體至今仍存在爭(zhēng)議。目前已有的研究顯示中樞內(nèi)GPR39和促腎上腺皮質(zhì)激素(corticotropinreleasing factor，CRF)受體(包括CRF-1和CRF-2)可以介導(dǎo)obestatin的作用且迷走神經(jīng)參與該作用[7]。

目前對(duì)obestatin在糖尿病大鼠中的作用多集中在外周消化系統(tǒng)和對(duì)血糖水平的調(diào)控上。至今鮮有文獻(xiàn)報(bào)道中樞obestatin對(duì)糖尿病大鼠的胃運(yùn)動(dòng)有怎樣的調(diào)節(jié)功能。海馬內(nèi)有CRF-1受體的表達(dá)，而ARC中有obestatin的表達(dá)[8]。海馬與下丘腦之間有廣泛的雙向纖維聯(lián)系[9]，由此我們推測(cè)，海馬和ARC之間可能存在obestatin通路，參與對(duì)胃腸運(yùn)動(dòng)的調(diào)控并在糖尿病早期胃腸動(dòng)力障礙的發(fā)病中起一定作用。本研究將集中探討是否存在A(yíng)RC-海馬obestatin神經(jīng)通路？該通路在糖尿病大鼠有何改變？此種改變?cè)谔悄虿∥高\(yùn)動(dòng)功能紊亂中起著怎樣的作用？本研究將通過(guò)中樞核團(tuán)定位給藥，清醒大鼠胃運(yùn)動(dòng)記錄，胃排空以及熒光逆行追蹤等手段，探討以上問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量(270±20) g，大鼠飼養(yǎng)于室溫(25±2)℃、晝夜循環(huán)光照(08:00 至20:00)的環(huán)境，給予標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室飲食，自由進(jìn)食和飲水。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均嚴(yán)格按《青島大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用管理辦法》執(zhí)行。

1.2 糖尿病大鼠模型制備及實(shí)驗(yàn)分組

113只大鼠給予10 %果糖溶液4周誘導(dǎo)大鼠胰島素抵抗后，腹腔注射30 mg/kg鏈脲佐菌素，每日1次，連續(xù)2 d。給藥一周后測(cè)量大鼠餐后血糖，選取餐后血糖>300 mg/dl的大鼠作為糖尿病大鼠進(jìn)行后續(xù)研究，共制備糖尿病大鼠80只，造模失敗大鼠棄去不用。

造模完成后，隨機(jī)選取5只正常大鼠，5只糖尿病大鼠立即進(jìn)行PCR研究；5只正常大鼠，5只糖尿病大鼠立即注射FG，并于7 d后取腦制備腦冠狀位冰凍切片，進(jìn)行ARC-海馬obestatin神經(jīng)通路構(gòu)成研究；在obestatin對(duì)大鼠胃運(yùn)動(dòng)及胃排空的影響研究中，每部分均使用正常大鼠及糖尿病大鼠各35只，分為5組，每組含正常及糖尿病大鼠各7只：(1)對(duì)照組；(2)0.1 pmol obestatin組；(3)1 pmol obestatin組；(4)10 pmol obestatin組；(5)10 pmol obestatin + 60 pmol NBI27914組。各組通過(guò)置管分別向海馬內(nèi)注射0.5 μl obestatin(0.1 pmol、1 pmol、10 pmol)， 0.5 μl混合液(10 pmol obestatin + 60 pmol NBI27914)，對(duì)照組注射等量的生理鹽水。給藥后記錄大鼠胃運(yùn)動(dòng)60 min，觀(guān)察大鼠胃運(yùn)動(dòng)改變，而胃排空研究則在給藥15 min后進(jìn)行。

1.3 PCR

隨機(jī)選取5只正常大鼠，5只糖尿病大鼠，經(jīng)10%水合氯醛腹腔麻醉(0.3 ml/100 g)后斷頭取腦，制備厚度為100 μm的腦組織冰凍切片，參照Paxinos & Watson大鼠腦圖譜，毛細(xì)管打孔獲取ARC。ARC置入研缽，添加少量液氮研磨后提取RNA，取2 μg RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行擴(kuò)增，Obestatin上游引物：5’-ATGGTGTCTTCAGCGACTATCT-3’；Obestatin下游引物：5’-CTCTGCTGGGCTTTCTGG-3’；β-Actin上游引物：5'-CACCCTGTGCTGCTCACCGAGGCC-3'；β-Actin下游引物：5'-CCACACAGATGACTTGCGCTCAGG-3'。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性1 min、64℃退火70 s、72℃延伸90 s，共33個(gè)循環(huán)；最后以2%瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物，觀(guān)察并比較正常及糖尿病大鼠ARC obestatin mRNA表達(dá)異同。

1.4 逆行追蹤與免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)

隨機(jī)選取5只正常大鼠，5只糖尿病大鼠，經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)麻醉后，俯臥位固定于三維腦立體定位儀，充分暴露顱骨及前囟，根據(jù)Paxinos & Watson大鼠腦圖譜，定位海馬(Hippocampus，AP： 4.0 mm；LR： 2.0 mm；H： 2.5 mm)，并注射0.2 μl 3%(w/v)熒光金(FG)，縫合切口，碘伏消毒。手術(shù)后連續(xù)3 d給予大鼠腹腔注射8×104U青霉素，以防止術(shù)后感染。

注射FG 7 d后，大鼠灌注固定后斷頭取腦，制作厚度為15 μm的腦冠狀冰凍切片，選取合適的組織切片，洗滌后微波修復(fù)5 min，封閉非特異性抗原2 h后一抗孵育過(guò)夜(抗obestatin抗體，稀釋濃度： 1∶400)，Cy3標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體孵育2 h，洗滌后防淬滅熒光封片油封片，用BX53熒光顯微鏡對(duì)結(jié)果進(jìn)行拍照。

1.5 大鼠胃運(yùn)動(dòng)記錄

1.5.1 核團(tuán)置管術(shù) 隨機(jī)選取35只正常大鼠，35只糖尿病大鼠，分組見(jiàn)1.2。大鼠禁食12 h后腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)麻醉，俯臥位固定于三維腦立體定位儀，充分暴露顱骨，向海馬(定位如上)植入一不銹鋼套管，使用牙托粉將套管固定于顱骨，縫合頭皮切口，分籠飼養(yǎng)，埋管術(shù)后連續(xù)給予大鼠腹腔注射8萬(wàn)單位青霉素3 d，預(yù)防術(shù)后感染。大鼠恢復(fù)一周后進(jìn)行胃運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)。

1.5.2 胃?jìng)鞲衅髦踩?大鼠經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)麻醉后，仰臥位固定于操作臺(tái)，充分暴露胃部，于胃竇漿膜面縫貼應(yīng)力傳感器，應(yīng)力傳感器的導(dǎo)線(xiàn)經(jīng)皮下引至頸部固定，并露出2～3 cm，逐層縫合腹部切口。術(shù)后給予動(dòng)物正常飲食3 d。

1.5.3 大鼠胃運(yùn)動(dòng)記錄 大鼠胃運(yùn)動(dòng)記錄前禁食18 h，在給藥前先穩(wěn)定記錄胃基線(xiàn)運(yùn)動(dòng)30 min，通過(guò)顱內(nèi)置管緩慢給藥，對(duì)照組注射等體積生理鹽水。給藥后記錄胃運(yùn)動(dòng)60 min，觀(guān)察給藥后胃收縮頻率和幅度的變化，并計(jì)算變化率。每只大鼠每天記錄1～2 h，至少持續(xù)2 d。胃收縮幅度和頻率變化率的計(jì)算公式如下：胃收縮幅度和頻率變化率%=(注射藥物后胃收縮幅度和頻率-注射藥物前胃收縮幅度和頻率)/注射藥物前胃收縮幅度和頻率×100%

1.6 胃排空研究

隨機(jī)選取35只正常大鼠，35只糖尿病大鼠，分組見(jiàn)1.2。實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食18 h，大鼠經(jīng)腦置管給藥15 min后經(jīng)口灌胃1.5 ml酚紅，灌胃20 min后處死大鼠，結(jié)扎大鼠胃部的幽門(mén)及賁門(mén)，收集胃內(nèi)容物置于100 ml 0.1 mol/L NaOH中，攪拌混勻后室溫靜置1 h，取5 ml上清液加入0.5 ml 20%三氯乙酸，混勻后3 000 g離心20 min，取1 ml上清液加入4 ml NaOH(0.5 mol/L)混勻，倒入比色皿。采用分光光度計(jì)測(cè)量在560 nm處的吸光值。標(biāo)準(zhǔn)品處理同上，僅不含胃及胃內(nèi)容物。胃排空率(%)=(1 - 樣本A560/標(biāo)準(zhǔn)品A560)×100%

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 糖尿病大鼠ARC obestatin mRNA表達(dá)的變化

PCR研究結(jié)果顯示，與正常大鼠相比，糖尿病大鼠ARC內(nèi)obestatin mRNA表達(dá)量顯著下降(相對(duì)表達(dá)量： 0.94±0.16vs0.68±0.19，P<0.05，圖1，表1)。

Fig. 1 The expressions of obestatin mRNA in normal and diabetic rat (n=5)

2.2 糖尿病大鼠ARC-海馬obestatin神經(jīng)通路的構(gòu)成

大鼠海馬微量注射FG，7 d后可在A(yíng)RC觀(guān)察到被FG標(biāo)記的神經(jīng)元(正常大鼠：圖2B、E；糖尿病大鼠：圖2H、K)，在同一切片上進(jìn)行obestatin免疫熒光組化染色，熒光顯微鏡下可見(jiàn)紅色熒光的obestatin免疫陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞(正常大鼠：圖2A、D；糖尿病大鼠：圖2G、J)，其中部分obestatin免疫陽(yáng)性神經(jīng)元也被FG標(biāo)記(正常大鼠：圖2C、F；糖尿病大鼠：圖2I、L)。結(jié)果提示，ARC內(nèi)部分obestatin免疫陽(yáng)性神經(jīng)元可發(fā)出神經(jīng)纖維投射至海馬，即ARC-海馬間有obestatin神經(jīng)通路。

與正常大鼠相比，糖尿病大鼠ARC FG/obestatin雙標(biāo)神經(jīng)元數(shù)目顯著減少(22.47±5.26 cells/ 0.01 mm2vs16.43±4.08 cells/0.01 mm2，P< 0.05)，提示，糖尿病大鼠ARC-海馬obestatin神經(jīng)投射減少。

Fig. 2 The obestatin neural pathway between ARC and hippocampus of normal and diabetic rat

2.3 海馬微量注射obestatin對(duì)糖尿病大鼠胃運(yùn)動(dòng)的影響

正常和糖尿病大鼠海馬內(nèi)微量注射obestatin，可劑量依賴(lài)性的抑制大鼠胃收縮幅度(P<0.01，圖3A，C)和頻率(P<0.01，圖3B，D)。海馬微量注射obestatin 5 min后，大鼠胃收縮頻率和幅度開(kāi)始下降，并且大約在給藥后10～15 min下降達(dá)到峰值(圖3A-D)。海馬內(nèi)微量注射CRFR1受體拮抗劑NBI27914，可部分阻斷obestatin對(duì)大鼠胃運(yùn)動(dòng)的抑制作用，提示，obestatin對(duì)大鼠胃運(yùn)動(dòng)的調(diào)控可能受CRFR1受體信號(hào)通路的影響。

Fig. 3 Effects of hippocampal injection of obestatin on the amplitude and frequency of gastric contraction in normal and diabetic rats

采用胃運(yùn)動(dòng)指數(shù)(%MI)對(duì)胃運(yùn)動(dòng)變化進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，正常及糖尿病大鼠%MI無(wú)顯著差異(P>0.05，表1)，海馬微量注射obestatin，能夠劑量依賴(lài)性的抑制正常及糖尿病大鼠%MI(P<0.05～0.01，表1)，并且10 pmol正常對(duì)照組大鼠%MI下降最為顯著(P<0.05，表1)。Obestatin對(duì)%MI的抑制作用可被NBI27914部分阻斷(P<0.05，表1)。

Tab. 1 Effects of Obestatin in the hippocampus on the %MI and gastric emptying of normal and diabetic rats (%， n=7)

2.4 海馬微量注射obestatin對(duì)糖尿病大鼠胃排空的影響

正常大鼠下丘腦海馬微量注射obestatin可劑量依賴(lài)性的抑制大鼠胃排空(P<0.05～0.01，表1)，且隨著obestatin劑量升高，obestatin對(duì)胃排空的抑制作用顯著增強(qiáng)(P<0.05～0.01，表1)，CRFR1阻斷劑NBI27914能夠部分阻斷obestatin對(duì)大鼠胃排空的抑制效應(yīng)(P<0.05，表1)。糖尿病大鼠海馬微量注射obestatin也表現(xiàn)出與正常大鼠相類(lèi)似的結(jié)果，但與正常大鼠相比，obestatin對(duì)糖尿病大鼠胃排空的抑制作用顯著減弱(P<0.05，表1)。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，與正常大鼠相比，糖尿病大鼠ARC obestatin合成減少；ARC-海馬間有obestatin神經(jīng)通路，且與正常大鼠相比，糖尿病大鼠ARC-海馬obestatin神經(jīng)投射減少；海馬微量注射obestatin可劑量依賴(lài)性的抑制胃運(yùn)動(dòng)及胃排空，該效應(yīng)可被CRFR1阻斷劑NBI27914部分阻斷，且與正常大鼠相比，obestatin對(duì)糖尿病大鼠胃運(yùn)動(dòng)及胃排空的抑制作用顯著減弱。

目前越來(lái)越多研究顯示，胃腸道與大腦間存在復(fù)雜的調(diào)節(jié)環(huán)路，能夠相互調(diào)控，并且該過(guò)程中涉及的腦區(qū)較多，目前主要認(rèn)為與此有關(guān)的三個(gè)主要的腦區(qū)為，調(diào)節(jié)能量平衡的下丘腦、調(diào)節(jié)享樂(lè)和動(dòng)機(jī)的腹側(cè)被蓋區(qū)以及調(diào)節(jié)認(rèn)知情緒的海馬[10]。最早被學(xué)者提出的經(jīng)典的胃運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)中樞在下丘腦，其中LHA，VMH，PVN和ARC都是重要的參與攝食、胃運(yùn)動(dòng)調(diào)控的核團(tuán)。另外，作為學(xué)習(xí)、記憶和認(rèn)知、情緒調(diào)控中樞海馬不僅接受來(lái)自下丘腦的神經(jīng)纖維投射同時(shí)還發(fā)送下行纖維調(diào)控下丘腦的活動(dòng)，共同參與胃運(yùn)動(dòng)的調(diào)控[10,11]。本研究通過(guò)熒光金逆行示蹤結(jié)合熒光免疫組化實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)ARC內(nèi)部分obestatin免疫陽(yáng)性神經(jīng)元可發(fā)出神經(jīng)纖維投射至海馬。該結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了海馬和下丘腦之間有纖維聯(lián)系，并對(duì)該理論做了進(jìn)一步補(bǔ)充，對(duì)投射神經(jīng)元做了定性。已有的研究顯示下丘腦的obestatin神經(jīng)元對(duì)胃運(yùn)動(dòng)有調(diào)控作用[12,13]，而進(jìn)食又可以對(duì)情緒起到一定的調(diào)節(jié)作用。雖然本實(shí)驗(yàn)未對(duì)情緒認(rèn)知功能進(jìn)行檢測(cè)，但以往的研究報(bào)道顯示，obestatin也參與學(xué)習(xí)記憶和情緒的調(diào)控[14]。據(jù)此推測(cè)ARC-海馬的obestatin神經(jīng)纖維投射可能參與obestatin對(duì)情緒的調(diào)控，進(jìn)而影響到胃運(yùn)動(dòng)。

同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)，與正常大鼠相比，糖尿病大鼠ARC-海馬obestatin神經(jīng)投射減少，并且PCR研究結(jié)果表明，糖尿病大鼠ARC obestatin mRNA表達(dá)也明顯減少。提示在糖尿病大鼠，下丘腦ARC與海馬之間obestatin信號(hào)通路發(fā)生改變。Obestatin有抑制攝食減弱胃運(yùn)動(dòng)的作用。由此推測(cè)，糖尿病患者早期多食，胃腸運(yùn)動(dòng)功能亢進(jìn)等癥狀，可能和下丘腦ARC與海馬之間obestatin信號(hào)通路減弱有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)的功能學(xué)研究顯示，obestatin可劑量依賴(lài)性的抑制大鼠胃運(yùn)動(dòng)及胃排空。這與以往報(bào)道的obestatin在能量代謝的調(diào)控中作用相一致[15,16]。與正常大鼠相比，obestatin對(duì)糖尿病大鼠胃運(yùn)動(dòng)及胃排空的抑制效應(yīng)顯著減弱。這與本研究觀(guān)察到的糖尿病大鼠ARC-海馬obestatin信號(hào)通路減弱的結(jié)果相一致。

綜上所述，本研究首次將下丘腦攝食整合中樞與海馬學(xué)習(xí)記憶/情感中樞相關(guān)聯(lián)，探討obestatin對(duì)糖尿病胃腸功能障礙的影響，結(jié)果顯示，ARC-海馬存在obestatin神經(jīng)通路，該通路的抑制可能是早期糖尿病大鼠胃動(dòng)力紊亂的發(fā)病機(jī)制之一。本研究可為臨床治療糖尿病胃動(dòng)力障礙提供參考。