楊 瀅，樓玫娟，李子林，陳 靜，吳 斐，黃曉宇，郭春蘭，張林平*

（1. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 鄱陽(yáng)湖流域森林生態(tài)系統(tǒng)保護(hù)與修復(fù)國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江西 南昌 330045；2. 江西省資溪縣森林病蟲(chóng)害防治檢疫站, 江西 資溪 335300；3. 九連山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局，江西 龍南 341702）

【研究意義】雷竹（Phyllostachys praecoxf.prevelnalis）屬禾本科，是我國(guó)特有的優(yōu)良筍用竹[1]。但是，隨著種植面積的不斷擴(kuò)大，連年的覆被和不科學(xué)的施肥導(dǎo)致雷竹種植區(qū)大面積的竹林林地土壤退化越來(lái)越嚴(yán)重[2]。植物內(nèi)生菌是指對(duì)植物來(lái)說(shuō)不會(huì)造成明顯病害，且在其整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段的某一階段生活在植物組織內(nèi)的一類(lèi)微生物，主要包括內(nèi)生真菌、內(nèi)生細(xì)菌、內(nèi)生放線菌[3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來(lái)，植物內(nèi)生菌作為潛在的外源基因載體和生防資源，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域中發(fā)揮著重要作用[4]。內(nèi)生真菌與寄主植物互惠共生，同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物[5]，其主要活性成分有抗腫瘤活性[6-7]、抑菌活性[8-9]、抗氧化活性[10-12]和抗病毒活性[13-15]等。從禾本科植物分離得到的內(nèi)生真菌種類(lèi)繁多，一般情況下，所屬地區(qū)不同，內(nèi)生真菌的種類(lèi)也不同，具有較為明顯的差異，植物不同部位之間多樣性差異也較為明顯[16-17]。同時(shí)，大量研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌與禾本科宿主植物之間的互作有助于宿主植物抵抗病原菌，提高適應(yīng)生存環(huán)境的能力[18-19]。【本研究切入點(diǎn)】本研究以植物內(nèi)生菌為切入點(diǎn)，明確雷竹內(nèi)生真菌資源，探究?jī)?nèi)生真菌的功能性?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】雷竹集約化經(jīng)營(yíng)過(guò)程中存在有機(jī)覆蓋物難降解、土壤退化嚴(yán)重、雷竹病害區(qū)域發(fā)生嚴(yán)重等問(wèn)題，探究雷竹根系中是否存在多功能性內(nèi)生真菌，并通過(guò)微生物途徑解決上述關(guān)鍵問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 研究材料

1.1.1樣品及供試病原菌雷竹根部樣品于2019年7月采自江西省林業(yè)科學(xué)院竹子園；油茶炭疽病菌（Colletotrichum camelliae）、獼猴桃果腐病菌（Neofabraea actinidiae）、毛竹枯梢病菌（Ceratosphaeria phyllostachydis）等供試病原菌均由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)森林保護(hù)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2培養(yǎng)基纖維素剛果紅培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、PDB培養(yǎng)基等配方參考張喜慶等[20]。

1.2 研究方法

1.2.1雷竹根部?jī)?nèi)生真菌的分離將采集的雷竹根部樣品用自來(lái)水清洗干凈以除去根表面泥沙等雜質(zhì)，用無(wú)菌水清洗3遍，然后用過(guò)濾紙吸干表面水分，過(guò)濾紙使用前進(jìn)行高壓滅菌。根部?jī)?nèi)生真菌的分離具體參考王盈桐等[21]，內(nèi)生真菌純化后再轉(zhuǎn)接到PDA斜面4 ℃保藏備用。

1.2.2雷竹功能內(nèi)生真菌篩選重金屬耐受性菌株篩選操作方法參考曾松榮等[22]；病原菌抑菌活性內(nèi)生真菌篩選參考陳迪等[23]；纖維素降解內(nèi)生真菌篩選參考景如賢等[24]。

鉛耐受指數(shù)（TI）計(jì)算公式：

TI≥50%，則表示內(nèi)生真菌對(duì)Pb2+具有耐受能力，反之則表示對(duì)Pb2+不具備耐受能力。

1.2.3功能性內(nèi)生真菌鑒定采用形態(tài)學(xué)及 ITS 序列比對(duì)進(jìn)行鑒定[25]，將測(cè)定的序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相似性比較分析，用MEGA5.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，并建立系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌的分離

利用組織塊分離法，從雷竹根部共分離得到35株內(nèi)生真菌，表明雷竹根系內(nèi)生真菌資源較為豐富，部分分離純化的內(nèi)生真菌見(jiàn)圖1。

圖1 部分分離純化的內(nèi)生真菌

2.2 內(nèi)生真菌功能性篩選

2.2.1重金屬耐受性菌株篩選由表1可知，從雷竹根部中共篩選出具有重金屬耐受性的菌株有11株。其中菌株LZ022、菌株LZ033、菌株LZ020、菌株LZ034、菌株LZ035的TI值均高于100%；菌株LZ023、菌株LZ031、菌株LZ014、菌株LZ026、菌株LZ016、菌株LZ015的TI值均在60%～100%，表明以上11株菌株對(duì)重金屬鉛具有較強(qiáng)的耐受能力。

表1 具有耐受性的內(nèi)生真菌在一定Pb2+濃度下的TI值

2.2.2病原菌抑制的平板篩選雷竹內(nèi)生真菌對(duì)3種病原菌的抑制結(jié)果見(jiàn)圖2。菌株LZ031和菌株LZ012對(duì)毛竹枯梢病原菌、獼猴桃果腐病原菌、油茶炭疽病原菌均有抑制作用；而菌株LZ022、菌株LZ004、菌株LZ005僅對(duì)油茶炭疽病原菌有抑制作用。

圖2 部分內(nèi)生真菌對(duì)3種病原菌的抑制效果

2.2.3具有纖維素降解功能的內(nèi)生真菌篩選對(duì)雷竹內(nèi)生真菌進(jìn)行纖維素剛果紅平板培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，共篩選出7株菌株具有明顯的透明圈。菌株LZ011、菌株LZ033和菌株LZ028的D/d比值均高于3.0；菌株LZ008和菌株LZ003的D/d比值均為2.0～3.0；菌株LZ031和菌株LZ012的D/d比值均在1.0～2.0。表明菌株LZ011、菌株LZ033和菌株LZ028具有較好的纖維素降解能力(表2)。

表2 部分纖維素降解菌株D/d值

綜上所述，菌株LZ031對(duì)油茶炭疽病原菌、毛竹枯梢病原菌、獼猴桃果腐病原菌均有抑制作用，對(duì)重金屬具有耐受性，且具有較強(qiáng)纖維素降解能力。菌株LZ033對(duì)重金屬耐受能力強(qiáng)，且具有較強(qiáng)纖維素降解能力。因此，菌株LZ031和菌株LZ033都是具有潛在應(yīng)用價(jià)值的功能菌。

2.3 內(nèi)生真菌鑒定

2.3.1形態(tài)鑒定由表3可知，菌株LZ031形態(tài)特征與腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）基本一致，初步鑒定菌株LZ031為腐皮鐮刀菌。菌株LZ033形態(tài)特征則與蘆竹節(jié)菱孢（Arthrinium arundinis）基本一致，故初步鑒定為蘆竹節(jié)菱孢菌株LZ031和菌株LZ033的顯微結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3。

圖3 菌株LZ031（A）和LZ033（B）的顯微結(jié)構(gòu)

表3 菌株LZ031和菌株LZ033形態(tài)特征

2.3.2分子鑒定將菌株所測(cè)的ITS序列與GenBank及EzTaxon近緣種序列進(jìn)行同源性比對(duì)，利用MEGA5.0采用Neighbor Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。由圖4可知，菌株LZ031與鐮刀菌屬具有較高的序列相似性，且與Fusarium solani（KJ019829）在同一分支聚集，親緣關(guān)系最近。菌株LZ033與節(jié)菱孢屬具有較高的序列相似性，且與Arthrinium arundinis的親緣關(guān)系最近。

圖4 基于ITS序列構(gòu)建的菌株LZ031系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

綜合菌株形態(tài)特征和ITS序列分析，將菌株LZ031鑒定為腐皮鐮刀菌（F. solani），菌株LZ033鑒定為蘆竹節(jié)菱孢（A. arundinis）。

3 結(jié)論與討論

本研究從雷竹根部分離篩選出11株對(duì)鉛具有耐受能力的內(nèi)生真菌，其中5株對(duì)鉛表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受能力，TI>100%，表明植物內(nèi)生真菌在抵抗重金屬污染方面具有重要的作用，這與前人研究結(jié)果一致[26-28]。此外，本研究篩選出5株內(nèi)生真菌對(duì)油茶炭疽病原菌有拮抗作用，2株對(duì)毛竹枯梢病原菌有拮抗作用，2株對(duì)獼猴桃果腐病原菌有拮抗作用，其中菌株LZ031對(duì)油茶炭疽病原菌、毛竹枯梢病原菌、獼猴桃果腐病原菌均有較為明顯的拮抗作用，這與紀(jì)麗蓮[29-30]在病原菌抑制研究上結(jié)果一致。本研究采用羧甲基纖維素鈉平板法和剛果紅染色法[20]篩選出7株在降解纖維素方面具有顯著效果的內(nèi)生真菌菌株，其中3株具有較強(qiáng)的降解纖維素的能力，這表明雷竹根部的內(nèi)生真菌在降解纖維素方面具有較為豐富的資源。

植物中的內(nèi)生真菌種類(lèi)眾多，資源豐富，是一類(lèi)未被大量研究且前景廣闊的微生物。本研究從重金屬耐受，病原菌抑制，纖維素降解3個(gè)方面對(duì)從雷竹根部分離出來(lái)的內(nèi)生真菌進(jìn)行功能性初步篩選，研究結(jié)果表明，雷竹根部具有較為豐富的功能菌株資源。而對(duì)于菌株生物學(xué)特性、降解性能等方面的研究還不夠深入和廣泛，后期應(yīng)結(jié)合定量實(shí)驗(yàn)做進(jìn)一步的補(bǔ)充和完善。