李青，彭章麗，陳玲△，徐鵬，付雪峰

（1遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科結(jié)核病區(qū)，貴州 遵義；2遵義醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院 貴州省普通高等學(xué)校傳染病與生物安全特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義）

0 引言

結(jié)核病由結(jié)核分枝桿菌感染引起，是目前全球范圍內(nèi)頭號(hào)傳染病殺手，也是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的十大疾病之一?？顾崛旧ㄊ桥R床上最便捷快速的診斷方法[1]，但敏感度偏低，且無(wú)法區(qū)別結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（mycobacterium tuberculosis complex，MTBC）與 非 結(jié)核分枝桿菌（nontuberculous mycobacteria，NTM）。結(jié)核分枝桿菌分離培養(yǎng)是確診結(jié)核病最重要的依據(jù)，不僅能取得病原學(xué)結(jié)果，還能提供活的菌株和細(xì)菌組DNA，進(jìn)行傳統(tǒng)藥敏檢測(cè)，指導(dǎo)臨床治療，可以進(jìn)行全基因測(cè)序等獲取菌株的分子生物學(xué)信息[2,3]。目前改良羅氏固相培養(yǎng)法（lowenstein-jensen，L-J）是最流行的培養(yǎng)方法，也是結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但該方法耗時(shí)長(zhǎng)，給早期診斷和治療帶來巨大阻礙?？焖僖后w培養(yǎng)是新的分枝桿菌培養(yǎng)方法，不但能較快地發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌[4]，并且具有良好的菌株回收率。為此，本研究對(duì)本實(shí)驗(yàn)室隨機(jī)收集的120份標(biāo)本進(jìn)行快速液體培養(yǎng)法和改良固體羅氏培養(yǎng)法的對(duì)照研究，驗(yàn)證快速液體培養(yǎng)法在結(jié)核病診斷中的準(zhǔn)確性，評(píng)價(jià)它的優(yōu)缺點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源

本院呼吸醫(yī)學(xué)研究室收集的疑似或確診結(jié)核病患者的痰標(biāo)本101份，肺泡灌洗液9份，腦脊液2份，胸腔積液7份，腹腔積液1份，共計(jì)120份（標(biāo)本收集符合遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)所指定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并取得該委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者均簽署知情同意書）。其中男78例，女42例，年齡14-88歲，中位年齡56歲；其中76份痰標(biāo)本分別進(jìn)行抗酸染色（Ziehl—Neelsen，萋－尼法）鏡檢、改良羅氏（L-J）培養(yǎng)和快速液體培養(yǎng)法；44份標(biāo)本進(jìn)行Gene-Xpert MT/RIF、改良羅氏培養(yǎng)法和快速液體培養(yǎng)法。痰標(biāo)本要求為黏液痰、膿痰、干酪痰或血痰，所有標(biāo)本體積不少于2ml。

1.2 儀器及試劑

抗酸染色液、快速液體培養(yǎng)試劑由珠海貝索生物技術(shù)有限公司提供（抗酸染色液 貨號(hào)BA-4091；培養(yǎng)管 貨號(hào)BC9000；NALC法痰消化緩沖液 貨號(hào)BC1999；分枝桿菌液體培養(yǎng)添加劑 貨號(hào)BC9003）；改良羅氏培養(yǎng)基使用珠海市銀科醫(yī)學(xué)工程股份有限公司產(chǎn)品（貨號(hào)：1912131）；Gene-Xpert MTB/RIF樣本消化液及反應(yīng)盒購(gòu)于美國(guó)賽沛公司（貨號(hào)：1000166397）。相關(guān)儀器：離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀公司）；振蕩器（中國(guó)上海滬西分析儀器廠）；生物安全柜（美國(guó)Thermo公司）；顯微鏡（日本Olympμs公司）；分枝桿菌熒光檢測(cè)儀（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）；Gene-Xpert MTB/RIF檢測(cè)儀器（美國(guó)賽沛公司）。

1.3 方法

1.3.1 痰抗酸染色

萋－尼染色鏡檢：參照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》抗酸桿菌顯微鏡檢查標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及公司說明書進(jìn)行萋－尼染色和顯微鏡鏡檢[5]。

1.3.2 Gene-Xpert MTB/RIF

參照試劑盒說明書，將標(biāo)本 ( 痰、肺泡灌洗液、腦脊液、胸腔積液、腹腔積液) 與含氫氧化鈉及異丙醇的標(biāo)本處理液按體積比1:2混合，震蕩混勻，室溫靜置15min，待標(biāo)本完全液化后取2ml混合液轉(zhuǎn)移至反應(yīng)盒中，置于Gene-Xpert檢測(cè)儀器進(jìn)行全自動(dòng)檢測(cè),約2h即可在檢測(cè)軟件窗口直接讀取結(jié)果。

1.3.3 改良羅氏法[5]和快速液體培養(yǎng)法

試劑配制：標(biāo)本處理/去污染試劑0.5gNALC加入100ml痰消化緩沖液；分枝桿菌液體培養(yǎng)添加劑培養(yǎng)液1瓶BASO營(yíng)養(yǎng)劑復(fù)1瓶BASO 抑菌劑，每支BASO分枝桿菌液體培養(yǎng)管中加入0.8ml添加劑復(fù)溶物。

標(biāo)本前處理及接種：①將痰抗酸染色或Gene-Xpert MTB/RIF檢測(cè)剩余的痰、肺泡灌洗液、腦脊液等直接轉(zhuǎn)移至 50ml離心管中，胸腹腔積液均全部離心后取沉淀轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，視標(biāo)本性狀加入1-2倍標(biāo)本體積的新鮮配制的標(biāo)本處理試劑，旋緊蓋子，振蕩30-60s，室溫靜置15 min。②加入1×PBS 緩沖液至45ml，上下顛倒混合均勻，3000×g離心20min后棄上清，加入1×PBS緩沖液1 ml混勻。③取500μl樣本接種到液體培養(yǎng)管中并旋緊蓋子上下顛倒混勻，取500μl接種到改良羅氏培養(yǎng)基中并使液體均勻分布于培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.4 結(jié)果判讀

1.4.1 抗酸染色的結(jié)果判讀

藍(lán)色背景下抗酸桿菌呈紅色，外形細(xì)長(zhǎng)或略彎曲及有分枝生長(zhǎng)趨勢(shì)，結(jié)果判斷參照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》。

1.4.2 Gene-Xpert MTB/RIF結(jié)果判讀

檢測(cè)軟件窗口直接讀取結(jié)果，包括MTB陽(yáng)性，檢出高；MTB陽(yáng)性，檢出中；MTB陽(yáng)性，檢出低；MTB陽(yáng)性，檢出極低；MTB陰性。

1.4.3 液體培養(yǎng)結(jié)果判讀

從培養(yǎng)的第2 d開始每24 h使用分枝桿菌熒光檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)，熒光值≤12 為陰性，≥13 為陽(yáng)性，報(bào)告陽(yáng)性后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，再檢測(cè)確認(rèn)并進(jìn)行萋－尼染色復(fù)檢（從培養(yǎng)管底部吸取部分標(biāo)本進(jìn)行涂片抗酸染色，證實(shí)為抗酸分枝桿菌后報(bào)告分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性，此抗酸染色陰性并確認(rèn)無(wú)脫片等情況后報(bào)告污染）；標(biāo)本培養(yǎng)42 d分枝桿菌熒光檢測(cè)儀檢測(cè)仍提示為陰性結(jié)果時(shí)，報(bào)告分枝桿菌培養(yǎng)陰性。

1.4.4 改良固體羅氏培養(yǎng)法結(jié)果判讀

溫箱孵育接種后第3d、第7d分別觀察菌落的生長(zhǎng)情況，以便發(fā)現(xiàn)污染情況和非典型性結(jié)核分枝桿菌的生長(zhǎng)。以后每周觀察1次結(jié)果，若發(fā)現(xiàn)呈菜花狀表面粗糙的米黃色或白色菌落生長(zhǎng)者，經(jīng)抗酸染色證實(shí)為抗酸分枝桿菌，則報(bào)告分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性;若培養(yǎng)60d后仍無(wú)菌落生長(zhǎng)，則報(bào)告分枝桿菌培養(yǎng)陰性。

1.4.5 質(zhì)量控制

本實(shí)驗(yàn)操作人員均參加并通過中國(guó)疾病預(yù)防控制中心組織的結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)及藥敏測(cè)試和全國(guó)結(jié)核病分子診斷技術(shù)能力驗(yàn)證等培訓(xùn)及考試。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分別計(jì)算改良羅氏（L-J）培養(yǎng)和快速液體培養(yǎng)法的陽(yáng)性率、污染率、培養(yǎng)時(shí)間，計(jì)算兩種培養(yǎng)方法與抗酸染色鏡檢或Gene-Xpert MTB結(jié)果的陽(yáng)性符合率等；計(jì)量資料采用配對(duì)設(shè)計(jì)的t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用配對(duì)設(shè)計(jì)的卡方檢驗(yàn)進(jìn)行分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種培養(yǎng)方法的陽(yáng)性率比較

在所有120份標(biāo)本中，改良羅氏（L-J）培養(yǎng)和快速液體培養(yǎng)法的陽(yáng)性率分別為54.39%（62/114）和53.91%（62/115），差 異 無(wú) 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義（χ2=0.0037，P=0.95），聯(lián)合培養(yǎng)的陽(yáng)性率為70.83%（85/120），與單獨(dú)使用一種培養(yǎng)方法比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩種方法的污染率分別為5.00%（6/120）和4.17%（5/120），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0，P=1）。

76例（表1）進(jìn)行痰抗酸染色、改良羅氏（L-J）培養(yǎng)和快速液體培養(yǎng)法的標(biāo)本中，抗酸染色與兩種培養(yǎng)方法的陽(yáng)性符合率分別為78.26%（36/46）和82.61%（38/46），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.069，P=0.263）；兩種培養(yǎng)方法在抗酸染色陽(yáng)性標(biāo)本中的結(jié)果符合率為82.61%，在抗酸染色陰性標(biāo)本中的結(jié)果符合率為66.67%，總結(jié)果符合率為76.32%。44例（表2）進(jìn) 行Gene-Xpert MTB/RIF、改良羅氏（L-J）培養(yǎng)和快速液體培養(yǎng)法的標(biāo)本中，Gene-Xpert MTB結(jié)果與兩種培養(yǎng)方法的陽(yáng)性符合率分別為48.57%（17/35）和51.43%（18/35），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0，P=1），兩種培養(yǎng)方法在Gene-Xpert MTB陽(yáng)性標(biāo)本中的結(jié)果符合率為62.71%，在Gene-Xpert MTB陰性標(biāo)本中的結(jié)果符合率為100%，總結(jié)果符合率為72.73%；改良羅氏（L-J）培養(yǎng)法和快速液體培養(yǎng)法在所有標(biāo)本中的結(jié)果符合率為75.00%，在抗酸染色標(biāo)本和Gene-Xpert MTB檢測(cè)標(biāo)本之間的結(jié)果符合率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.048，P=0.827）。

表1 抗酸染色標(biāo)本的兩種培養(yǎng)方法比較（n）

表2 Gene-Xpert MTB標(biāo)本的兩種培養(yǎng)方法比較（n）

2.2 兩種培養(yǎng)方法的培養(yǎng)時(shí)間比較

在所有120份標(biāo)本中，改良羅氏（L-J）培養(yǎng)法的平均培養(yǎng)時(shí)間為（23.68±1.43）d，快速液體培養(yǎng)法的平均培養(yǎng)時(shí)間為（9.74±0.70）d，P＜0.0001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在痰抗酸染色陽(yáng)性標(biāo)本中，兩種培養(yǎng)方法的平均培養(yǎng)時(shí)間 分 別 為（21.03±1.87）d和（8.13±0.42）d，P＜0.0001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在Gene-Xpert MTB陽(yáng)性標(biāo)本中，兩種培養(yǎng)方法的平均培養(yǎng)時(shí)間分別為（29.88±2.93）d和（13.94±1.93）d，P＜0.0001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；由于痰抗酸染色陰性標(biāo)本數(shù)量較少，故未做統(tǒng)計(jì)分析，兩種培養(yǎng)方法在Gene-Xpert MTB陰性標(biāo)本中均未有陽(yáng)性結(jié)果，故無(wú)法計(jì)算平均培養(yǎng)時(shí)間。

3 討論

結(jié)核分枝桿菌的改良羅氏（L-J）培養(yǎng)法是結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)之一，但由于培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)、陽(yáng)性率低等原因，不利于患者的及時(shí)治療以及傳染源的控制，在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)中沒有普遍開展[6]。尋求比改良羅氏（L-J）培養(yǎng)法診斷效率更高或培養(yǎng)周期更短的結(jié)核菌培養(yǎng)方法一直是結(jié)核病診斷的研究熱點(diǎn)，此前文獻(xiàn)報(bào)道了MACTECTM MGITTM 960全自動(dòng)分枝桿菌快速培養(yǎng)藥敏分析系統(tǒng)的陽(yáng)性率和培養(yǎng)陽(yáng)性周期均明顯優(yōu)于改良羅氏（L-J）培養(yǎng)法[6,7]，但由于設(shè)備昂貴，無(wú)法在我國(guó)普及，尤其是在基層醫(yī)療單位和疾控中心。

本研究結(jié)果表明，快速液體培養(yǎng)法與改良羅氏（L-J）培養(yǎng)法相比，在陽(yáng)性率、污染率之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；說明快速液體培養(yǎng)法擁有同改良羅氏（L-J）培養(yǎng)法一樣的靈敏度和特異度。此外，由于Gene-Xpert MTB的檢測(cè)靈敏度高于抗酸染色，而檢測(cè)靈敏度與細(xì)菌載量有關(guān)，所以兩種檢測(cè)陽(yáng)性的標(biāo)本中細(xì)菌載量可能不同，因此，分別對(duì)抗酸染色或Gene-Xpert MTB標(biāo)本都進(jìn)行兩種培養(yǎng)方法培養(yǎng)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分層分析發(fā)現(xiàn)，痰抗酸染色或Gene-Xpert MTB與兩種培養(yǎng)方法的陽(yáng)性符合率之間的差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩種培養(yǎng)方法在所有抗酸染色或Gene-Xpert MTB標(biāo)本中的結(jié)果符合率之間的差異同樣無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但抗酸染色陽(yáng)性標(biāo)本的結(jié)果符合率高于Gene-Xpert MTB陽(yáng)性標(biāo)本，這證明了我們的猜想，無(wú)論是固體培養(yǎng)還是液體培養(yǎng)，培養(yǎng)陽(yáng)性率都可能與標(biāo)本中細(xì)菌載量有關(guān)。

我們還發(fā)現(xiàn)聯(lián)合培養(yǎng)的陽(yáng)性率達(dá)70.83%，與單獨(dú)使用其中一種培養(yǎng)方法的陽(yáng)性率相比均明顯提高了陽(yáng)性率，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高于此前Somosk?vi A 等所報(bào)道的結(jié)果，且我們的研究未出現(xiàn)兩種培養(yǎng)方法同時(shí)污染的標(biāo)本，有效降低了污染率，這說明聯(lián)合兩種方法進(jìn)行培養(yǎng)既可以提高陽(yáng)性率，也能有效降低污染率，提高了菌株回收率，能為進(jìn)一步的藥敏試驗(yàn)或全基因組測(cè)序等提供更多的標(biāo)本，有利于患者的診斷和治療。

與改良羅氏（L-J）培養(yǎng)法相比，快速液體培養(yǎng)法無(wú)論是在所有標(biāo)本中，還是在抗酸染色陽(yáng)性或Gene-Xpert MTB陽(yáng)性標(biāo)本中都大大縮短了培養(yǎng)時(shí)間（平均縮短2周左右），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這為臨床及早診斷、制訂個(gè)性化治療方案提供了更加及時(shí)、準(zhǔn)確的臨床依據(jù)，該結(jié)果與此前報(bào)道的多數(shù)相關(guān)研究相似。除培養(yǎng)陽(yáng)性率與標(biāo)本中細(xì)菌載量有關(guān)外，培養(yǎng)陽(yáng)性結(jié)果檢出時(shí)間也與之相關(guān)。

病原學(xué)檢測(cè)是結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，抗酸染色法是臨床上最便捷快速的診斷方法，但敏感度低且無(wú)法區(qū)別MTB與NTM；GeneXpert MTB/RIF和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法均為分子檢測(cè)手段，檢測(cè)時(shí)間短，能較快地進(jìn)行分枝桿菌核酸檢測(cè)[8-10]，GeneXpert MTB/RIF還能獲得利福平耐藥信息，但這兩種方法不能獲得MTB菌株，也不能進(jìn)一步進(jìn)行其他抗結(jié)核藥物的耐藥性檢測(cè)及全基因測(cè)序等深度分析；分枝桿菌培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)是可以獲得患者不同時(shí)期的菌株并可以進(jìn)行大多數(shù)抗結(jié)核藥物的耐藥性檢測(cè)及進(jìn)行全基因組測(cè)序[2,3]，可以對(duì)菌株的進(jìn)化及疾病的發(fā)生發(fā)展傳播等提供有力依據(jù)，并且有文獻(xiàn)報(bào)道，分枝桿菌培養(yǎng)技術(shù)在痰和肺泡灌洗液中的陽(yáng)性檢出率高于痰抗酸染色和GeneXpert MTB/RIF[11]，但分枝桿菌培養(yǎng)的缺點(diǎn)也很明顯，就是檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，尤其是改良羅氏（L-J）培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)4-8周，嚴(yán)重影響了患者當(dāng)前的診斷和治療。因此，探索既能保留分枝桿菌培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，又能實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)的方法是當(dāng)前結(jié)核病診斷技術(shù)開發(fā)的重要研究方向。

本實(shí)驗(yàn)采用的快速液體培養(yǎng)法是我國(guó)自主研發(fā)的手工熒光讀數(shù)儀，操作簡(jiǎn)單，方便易行，目前已在國(guó)內(nèi)多個(gè)省份的基層醫(yī)院和疾控中心中推廣，因此，快速液體培養(yǎng)法是一種比較理想的分枝桿菌快速培養(yǎng)方法，設(shè)備簡(jiǎn)單、操作便捷，與改良羅氏（L-J）培養(yǎng)相比同樣具有敏感度高、特異性強(qiáng)、符合率高的特點(diǎn)[12]。是一種快速、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用、有效的檢測(cè)方法，適合在基層結(jié)核病防治結(jié)構(gòu)推廣應(yīng)用。