王艷玲，趙 巖，陳 銘，施郁松，徐 俊，李帥帥，唐首杰，趙金良

（上海海洋大學(xué)/水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室/水產(chǎn)動物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201306）

我國鹽堿水面積大，廣泛分布于東北、西北、華北等內(nèi)陸地區(qū)，水質(zhì)類型多樣，以碳酸鹽型居多[1]。過高的碳酸鹽堿度對魚類有強烈的毒害作用，如環(huán)境中氫氧根離子 (OH?)、碳酸氫根離子(HCO3?)、碳酸根離子 (CO32?) 等直接作用于魚類的鰓上皮細胞，造成器質(zhì)性損傷[2]；魚類鰓內(nèi)二氧化碳分壓 (pCO2) 隨碳酸鹽堿度的升高維持在較低水平，導(dǎo)致低碳酸血癥和呼吸性堿中毒[3-4]；魚體內(nèi)的氨氣 (NH3) 不能與氫離子 (H+) 結(jié)合排出體外，發(fā)生氨中毒等[5]。魚類可以通過改變鰓組織的形態(tài)、調(diào)整含氮產(chǎn)物的代謝和排泄等方式適應(yīng)高堿度環(huán)境[6-8]，基因的差異表達也是魚類應(yīng)答堿脅迫的途徑之一[9-11]。不同魚類對碳酸鹽堿度的耐受性不同，目前國內(nèi)外已有對包括青海湖裸鯉 (Gymnocypris przewalskii) 在內(nèi)的20多種魚類堿耐受性的報道[7-8,12-23]，但多數(shù)是在極端高堿環(huán)境下經(jīng)過進化具有生存優(yōu)勢的魚類，如馬加迪湖羅非魚[7](Oreochromis alcalicus grahami)、金字塔湖克拉克大麻哈魚[8](Oncorhynchus clarki henshawi)、凡湖塔氏卡拉白魚[12](Chalcalburnus tarichi) 等，且研究過程中往往脅迫方式比較單一、統(tǒng)計處理也比較簡單。

尼羅羅非魚 (O. niloticus) 生長速度快，是世界上最廣泛養(yǎng)殖的魚類之一，2019年我國養(yǎng)殖產(chǎn)量為1.64×104t[24]。尼羅羅非魚也是一種廣鹽性魚類，具有在鹽堿水域中養(yǎng)殖推廣的潛力。有關(guān)尼羅羅非魚對氯化鈉 (NaCl) 鹽度耐受性的研究較多[25-28]，但對碳酸鹽堿度耐受性的報道較少。雷衍之等[29]發(fā)現(xiàn)當(dāng)水體總堿度為 48.2 me·L?1時，相較于鰱 (Hypophthalmichthys molitrix)、鳙 (H. nobilis)、草魚(Ctenopharyngodon idella) 等淡水魚，尼羅羅非魚存活時間更長，但該堿度計量單位目前使用較少；趙巖等[30]發(fā)現(xiàn)，尼羅羅非魚在 4和 6 g·L?1的碳酸鹽堿水體中脅迫 48 h 無死亡個體，10 g·L?1堿環(huán)境下的開始死亡時間明顯早于8 g·L?1，但并未計算準(zhǔn)確的半致死濃度 (LC50)。此外，在對尼羅羅非魚進行耐鹽堿新品種的選育過程中，為了優(yōu)化選育和馴化方案，也需要對其鹽堿耐受性進行全面深入的評估。

本研究以體質(zhì)量差異3倍以上的大、小2種規(guī)格的尼羅羅非魚幼魚為對象，用碳酸氫鈉 (NaHCO3)配置不同濃度的堿性水體，通過高濃度堿脅迫致死、急性堿脅迫和慢性堿馴化3種不同的脅迫方法，系統(tǒng)研究了尼羅羅非魚對碳酸鹽堿度的耐受性能，為其鹽堿選育和鹽堿水養(yǎng)殖提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗自2020年10月1日起于上海海洋大學(xué)羅非魚種質(zhì)資源試驗站進行。實驗用魚為新吉富羅非魚品系后代。挑選同年繁殖且大、小2種規(guī)格 [ 大：(21.56±0.27) g，?。?5.92±0.03) g] 的魚進行實驗。正式實驗前暫養(yǎng)24 h，暫養(yǎng)期間不投喂，選取體質(zhì)健康、活力較強、大小均勻的個體。實驗用水提前配置，根據(jù)水族箱 (46 cm×38 cm×31.5 cm) 體積計算所需NaHCO3(分析純) 的質(zhì)量，將相應(yīng)NaHCO3加至完全曝氣的自來水中，均勻攪拌，連續(xù)充氧，待其穩(wěn)定后使用。

1.2 實驗設(shè)計

1.2.1 高濃度堿脅迫致死實驗 將大、小規(guī)格實驗魚由淡水分別直接移入碳酸鹽堿度為30和22 g·L?1水體中。發(fā)現(xiàn)死魚立即撈出，記錄每尾魚的死亡時間。每組每種魚設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)30尾。

1.2.2 急性堿脅迫實驗 根據(jù)預(yù)實驗，大規(guī)格實驗組設(shè)置 8、9、10 g·L?13個堿度梯度，小規(guī)格實驗組設(shè)置 6、7、8 g·L?13個堿度梯度。將暫養(yǎng)后的實驗魚直接放入不同堿度組的水箱內(nèi)，每組40尾，設(shè)3個平行，充分曝氣的自來水組為對照，進行96 h急性堿脅迫實驗。實驗開始后，每4 h觀察記錄死亡情況。

1.2.3 慢性堿馴化實驗 水體起始堿度為 0 g·L?1，分別以+2、+4、+6 g·(L·d)?1的速度增加碳酸鹽堿濃度來進行實驗。每組40尾魚，3個重復(fù)。實驗開始后，每12 h觀察記錄死亡情況。實驗期間用氣泵不間斷充氧，水溫19～24 ℃，不喂食不換水，用虹吸管吸出糞便以保持水體清潔。以實驗魚靜臥水箱底部、呼吸停止、用玻璃棒觸碰無反應(yīng)為死亡標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用 MATLAB 8.4、Systat Sigma Plot 10.0和 DPS軟件對所得實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

1.3.1 高濃度堿脅迫致死實驗 計算平均存活時間 (Mean surviving time, MST, min)，以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 ()”表示。

1.3.2 急性堿脅迫實驗 繪制隨時間-堿度變化的累計死亡率觀察值圖；將累計死亡率轉(zhuǎn)換成概率單位后，用線性回歸模型擬合堿度與累計死亡率的回歸方程，求出96 h LC50；用互補重對數(shù)模型(Complementary log-log model, CLL) 擬合不同堿度處理下大、小規(guī)格魚各時間區(qū)間的累計死亡率曲面，模型擬合在DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)下進行[31]。

其中實驗魚在時間 tj(j=12, 24,···, J) 被作用因子 (NaHCO3) 的劑量 di(i=6, 7,···, I) 致死的概率可表達為：

式中：β為描述劑量效應(yīng)的待估參數(shù)；τj為至?xí)r間tj的時間效應(yīng)參數(shù)；pij為劑量di在0到j(luò)個時間單位內(nèi)產(chǎn)生的累計死亡概率 (Cumulative mortality)；劑量 di使受試個體在時間區(qū)間 [tj?1,tj] 內(nèi)可能遭受的死亡率稱為條件死亡概率 (Conditional mortality)，可表示為：

式 (2) 中 β 的含義與式 (1) 相同。γj為描述時間區(qū)間 [tj?1, tj] 內(nèi)時間效應(yīng)的待估參數(shù)，與 τj在時間上的含義有所區(qū)別。γj和β通過二項分布最大似然函數(shù)逼近獲得。對模型的擬合值與實測值之間的差異，分別采用Pearson卡方檢驗及Hosmer-Lemoshow統(tǒng)計量來檢驗?zāi)Ｐ偷臄M合度高低。

1.3.3 慢性堿馴化實驗 繪制隨時間-堿度變化的累計死亡率觀察值圖；用Logistic模型擬合累計死亡率和脅迫時間的關(guān)系曲線，分別求出致死堿度范圍和LC50。

2 結(jié)果

2.1 高濃度堿脅迫致死實驗

將實驗魚分別移入碳酸鹽堿水體中，3 h內(nèi)均全部死亡，但大規(guī)格魚在高脅迫濃度下，MST為 (136.92±3.72) min，仍長于小規(guī)格魚 [(114.08±4.36) min]。

2.2 急性堿脅迫實驗

實驗期間，對照組呼吸與游動保持正常，水質(zhì)較清澈，全程未出現(xiàn)死亡個體，而堿脅迫組實驗魚陸續(xù)死亡。大規(guī)格魚在碳酸鹽堿度為8 g·L?1時，無強烈應(yīng)激表現(xiàn)，前24 h未出現(xiàn)死亡，隨時間延長累計死亡率上升較平緩，96 h內(nèi)不足20%；碳酸鹽堿度為 9 g·L?1時，前 72 h 累計死亡率為 22.5%，72 h后迅速上升，脅迫96 h達到52.5%；碳酸鹽堿度為 10 g·L?1時，第 12小時即出現(xiàn)死亡，前 60 h累計死亡率小幅增長，60～72 h驟增，72 h死亡數(shù)達一半以上，96 h后僅剩少量存活 (圖1-a)；小規(guī)格魚在碳酸鹽堿度 6 g·L?1時，脅迫 48 h 未出現(xiàn)死亡，96 h累計死亡率不足50%；碳酸鹽堿度為7 g·L?1時，前 24 h 累計死亡率為 0，24～72 h 呈勻速變化 (6%, 14%, 22%, 30%)，72 h 后迅速增至64%；碳酸鹽堿度為8 g·L?1時，脅迫前期即開始死亡，出現(xiàn)急游沖撞、竄出水面、眼睛突出、眼白出血、呼吸運動加快等現(xiàn)象，脅迫60 h死亡已超半數(shù)，96 h后累計死亡率超過85% (圖1-b)，且死亡個體大多具有眼部凸起發(fā)黑、身體僵硬、腹腔積水等特征；同時水質(zhì)渾濁較快，含有大量泡沫。

圖1 尼羅羅非魚隨時間-堿度變化的累計死亡率觀察值Figure 1 Observed value of cumulative mortality of Nile tilapia with time-alkalinity change

基于線性回歸模型擬合堿度與累計死亡率的回歸方程，大、小規(guī)格急性脅迫96 h的LC50分別為8.95和 6.25 g·L?1(表 1)。

表1 基于線性回歸模型尼羅羅非魚累計死亡率的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis of cumulative mortality of Nile tilapia by linear regression model

進行各堿度各時間段累計死亡率的CLL模型擬合 (圖2)。在實驗設(shè)置的時間與堿度范圍內(nèi)，模擬的死亡概率是一個曲面，曲面的高度和變化均與觀察值曲面相近。CLL模型下，大、小規(guī)格實驗魚急性脅迫 96 h 的 LC50分別為 9.01和 6.35 g·L?1(表 2)。條件死亡率效應(yīng)參數(shù) (γ) 和累計死亡率效應(yīng)參數(shù) (τ) 估計值均隨脅迫時間的延長而增大；模型經(jīng)Pearson卡方檢驗及Hosmer & Lemeshow統(tǒng)計量檢驗均顯著相關(guān)；模型系數(shù)β、γj經(jīng)t檢驗相關(guān)極顯著 (P<0.01，表 2)。

表2 尼羅羅非魚互補重對數(shù)模型的參數(shù)估計及其顯著性檢驗Table 2 Estimated and tested parameters of complementary log-log model of Nile tilapia

圖2 互補重對數(shù)模型擬合尼羅羅非魚隨時間-堿度變化的累計死亡率Figure 2 Cumulative mortality of Nile tilapia estimated by CLL model with time-alkalinity change

2.3 慢性堿馴化實驗

大規(guī)格魚在3種堿變化速度下，累計死亡率波峰不顯著 (圖3-a)；小規(guī)格魚在3種堿變化速度下，其累計死亡率出現(xiàn)3個明顯的峰值，按時間先后分別為+6、+4和+2 g·(L·d)?1組 (圖 3-b)。實驗中以 2 g·(L·d)?1的幅度增加堿度，大、小規(guī)格實驗魚脅迫 96 h均未出現(xiàn)死亡，碳酸鹽堿度達 12 g·L?1時累計死亡率均為 100%；+4 g·(L·d)?1組在堿度達12 g·L?1時，大規(guī)格魚累計死亡半數(shù)以上，小規(guī)格魚全部死亡；+6 g·(L·d)?1組在堿度達 12 g·L?1時，大規(guī)格魚累計死亡24%，小規(guī)格魚累計死亡率從0升至100%。

圖3 尼羅羅非魚慢性堿馴化下的累計死亡率觀察值Figure 3 Observed value of cumulative mortality of Nile tilapia with gradual alkalinity

利用Logistic模型將尼羅羅非魚的累計死亡率和脅迫時間按照不同碳酸鹽堿度變化速度進行統(tǒng)計擬合 (圖4)，得出慢性堿馴化過程中實驗魚的致死堿度范圍及半致死堿度 (表3)。

圖4 Logistic模型擬合慢性堿馴化下尼羅羅非魚的累計死亡率Figure 4 Cumulative mortality of Nile tilapia estimated by Logistic model with gradual alkalinity

表3 慢性堿馴化下尼羅羅非魚累計死亡率相關(guān)分析Table 3 Correlation Analysis of cumulative mortality of Nile tilapia with gradual alkalinity

3 討論

LC50是衡量鹽堿水體對魚毒害影響的指標(biāo)[9]。常見魚類的 96 h LC50[13-21]見表 4。本實驗急性堿脅迫96 h大規(guī)格尼羅羅非魚的LC50為106.55×10?3mol·L?1，小規(guī)格的為 74.40×10?3mol·L?1(不同文獻中堿度單位有差異，此處統(tǒng)一按 1 g·L?1=84×10?6mol·L?1計算)?？梢娔崃_羅非魚的耐堿能力雖弱于青海湖裸鯉、卡拉白魚等耐高堿魚類，但仍強于大多淡水養(yǎng)殖魚類。另外，當(dāng)慢性馴化實驗中堿度為 12 g·L?1時，+2 g·(L·d)?1組累計死亡率均達 100%；+4 g·(L·d)?1組大規(guī)格魚累計死亡半數(shù)以上，小規(guī)格魚全部死亡；+6 g·(L·d)?1組小規(guī)格魚累計死亡率從0升至100%。推測碳酸鹽堿度12 g·L?1可能是尼羅羅非魚堿耐受能力的拐點。

表4 常見魚類急性脅迫96 h的半致死濃度Table 4 96 h LC50 values of alkalinity of common fish species

大規(guī)格魚的高濃度致死MST、急性堿脅迫96 h LC50[(136.92±3.72) min, 8.95 g·L?1] 均高于小規(guī)格[(114.08±4.36) min, 6.25 g·L?1]；慢性堿馴化下，大規(guī)格魚 LC50均高于 10 g·L?1，小規(guī)格魚的低于 10 g·L?1；大規(guī)格的生存堿度上限比小規(guī)格高1～4 g·L?1，死亡堿度下限與小規(guī)格差異不顯著。上述結(jié)果說明體質(zhì)量會影響魚類對環(huán)境的耐受性。在幼魚階段，體質(zhì)量增加3倍以上的羅非魚對碳酸鹽堿脅迫的耐受性顯著增強。值得注意的是，慢性堿馴化實驗中大規(guī)格魚LC50隨堿變化速度的增大而上升，小規(guī)格魚則隨堿變化速度的增大而下降，究其原因有2個：1) 慢性堿馴化實驗中，小規(guī)格魚累計死亡率出現(xiàn)3個明顯的峰值，而大規(guī)格魚死亡變化平緩，在碳酸鹽堿度達12 g·L?1時，小規(guī)格魚較大規(guī)格死亡情況更集中；2) 實際操作中堿度以脈沖式增加，堿度的擬合值較實測值準(zhǔn)確度可能較低，擬合曲線并未穿過全部數(shù)據(jù)點。

本研究在慢性堿馴化實驗中發(fā)現(xiàn)，同規(guī)格魚在不同堿變化速度下的存活時間不同。+2 g·(L·d)?1組實驗魚的存活時間較長 (大：144 h，?。?40 h)，+6 g·(L·d)?1組實驗魚較短 (大：68 h，?。?2 h)。+4 g·(L·d)?1組實驗魚存活時間 (大：92 h，?。?8 h)和+6 g·(L·d)?1組差異不顯著。盡管在較高的堿變化速度下，生存堿度上限、死亡堿度下限發(fā)生變化，但實際該數(shù)值變化并不會提高耐受性。因此認為在堿馴化過程中，堿度日增加2 g·L?1對尼羅羅非魚的存活更加友好，養(yǎng)殖中可通過 2 g·(L·d)?1的堿增加使其耐受更高濃度的碳酸鹽堿水體。另外，可以推測堿度日增加1 g·L?1時羅非魚存活時間更長，但馴化時間和成本也會相應(yīng)增加。

堿度對魚類的毒性具有劑量效應(yīng)和時間效應(yīng)[17]。CLL模型最先應(yīng)用在不同昆蟲的化學(xué)及生物殺蟲劑毒力測定的數(shù)據(jù)分析上，優(yōu)點在于可以揭示時間與劑量間的互作效應(yīng)，使實驗數(shù)據(jù)更充分更完整[31]。本研究引入CLL模型用于急性堿脅迫下尼羅羅非魚的“時間-堿度-死亡率”分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和線性回歸相比，CLL模型可直接反映不同時間區(qū)間的死亡變化情況，擬合程度更高，且脅迫過程中的時間效應(yīng)在數(shù)值上表現(xiàn)為逐漸增強 (大：?23.677 6