趙年樺，趙 賀，強 壯，聶竹蘭，魏 杰, ，沈建忠

（1. 塔里木大學動物科學學院，新疆維吾爾自治區(qū) 阿拉爾 843300； 2. 新疆生產(chǎn)建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆維吾爾自治區(qū) 阿拉爾 843300； 3. 塔里木珍稀魚類研究中心，新疆維吾爾自治區(qū) 阿拉爾 843300； 4. 塔里木大學生命科學學院，新疆維吾爾自治區(qū) 阿拉爾 843300； 5. 華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院，湖北 武漢 430070）

我國擁有約0.46億hm2的低洼鹽堿水域資源，廣泛分布在東北、華北和西北內(nèi)陸地區(qū)，但這些鹽堿水域資源中生物種類單一、生態(tài)環(huán)境脆弱，因此大部分長期處于荒廢狀態(tài)[1]。自1991年以來，我國開始在河北、山東、江蘇等地進行鹽堿水養(yǎng)殖[2]，但目前尚缺乏針對不同鹽堿水域特點的主導養(yǎng)殖技術(shù)，存在養(yǎng)殖品種單一的問題[3]。裂腹魚亞科主要分布在我國的青藏高原及其周邊水域[4-5]，近幾年由于受外界因素干擾，其數(shù)量急劇下降，大規(guī)模人工繁育成為保護裂腹魚的首要任務。

人工繁育過程中環(huán)境因子對幼魚的代謝、存活、攝食和生長起著重要作用，其中水溫、光周期和光照強度的影響尤為重要[6]。魚類是變溫動物，體溫隨著水溫而變化，水溫可以通過影響魚體體溫從而改變其消化酶活性，進而對魚類的攝食率、食物消化率和生長率產(chǎn)生重大影響[7]。魚類的攝食率和生長率隨水溫的升高而增加，但當水溫高于臨界值時卻會隨水溫的升高而下降[8]。魚類在整個生命周期中均受光照影響，光周期和光照強度對魚類攝食和生長有重要影響，光照過強或過弱和不適宜的光周期均會對魚類的活動、生長和發(fā)育產(chǎn)生不利影響[9]。

塔里木裂腹魚 (Schizothorax biddulphi)屬鯉形目、鯉科、裂腹魚亞科、裂腹魚屬，為國家二級保護魚種，僅分布于新疆塔里木水系[10]。近年來，塔里木裂腹魚繁殖生物學和生態(tài)學相關(guān)研究逐漸被重視[11-14]，但環(huán)境因子對其存活、攝食和生長的影響及其鹽堿耐受能力的研究尚未見報道。本文研究了水溫、光周期和光照強度對塔里木裂腹魚幼魚存活、攝食和生長的影響，以及塔里木裂腹魚幼魚對氯化鈉 (NaCl) 鹽度、碳酸氫鈉 (NaHCO3) 堿度和鹽堿交互的耐受性，以期為塔里木裂腹魚種群保護和養(yǎng)殖生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用塔里木裂腹魚幼魚采自新疆維吾爾自治區(qū)卡拉貝利魚類增殖放流站，初始體長為 (47.26±0.89) mm，體質(zhì)量為 (1.25±0.31) g。實驗容器為透明有蓋玻璃水缸 (60 cm×35 cm×45 cm)，實驗期間統(tǒng)一使用HZ-060型充氣增氧機供氧。實驗飼料為四川斯特佳飼料有限公司生產(chǎn)的浮性配合飼料838，每天投喂3次 (09:30、13:30、19:30)，按體質(zhì)量3.0%～5.0%飽食投喂。投餌前吸出糞便，投餌30 min后吸出殘餌，烘干稱質(zhì)量，調(diào)整投喂量。每天換水1次，每次換水1/3，換水前后溫差控制在0.5 ℃以內(nèi)。實驗用水為經(jīng)過循環(huán)系統(tǒng)過濾的卡拉貝利地下水，水溫 (16.5±0.5) ℃，pH 8.45～8.56，溶解氧質(zhì)量濃度 3.5～3.7 mg·L?1，鹽度 1.7～1.9，氨氮質(zhì)量濃度<0.1 mg·L?1。

1.2 水溫實驗設計

1.3 光周期實驗設計

實驗設 5 個光照周期組 (0 L∶24 D、8 L∶16 D、12 L∶12 D、16 L∶8 D 和 24 L∶0 D)，每組 3個平行，每組30尾幼魚，共15個玻璃水缸，每個實驗組分別放在獨立密閉遮光的實驗桶 (直徑為2 m、深度為 1 m) 中進行，每組采用 1個 36 W 日光燈進行照明，玻璃缸遮光材料選用黑色塑料布，實驗周期為 45 d。

1.4 光照強度實驗設計

實驗設 5個光照強度組 (2 000、1 000、500、100、10 lx)，每組3個平行，每組30尾幼魚，共15個玻璃水缸，均勻排成5列，4個36 W日光燈燈光從第一列玻璃缸壁外上方射入，移動各列玻璃缸間距，使光強在玻璃缸中形成10～2 000 lx的光照梯度，光照周期為自然光周期 (12 L∶12 D)，實驗周期為 45 d。

1.5 多因素調(diào)控實驗設計

采用三因素 (水溫、光周期、光照強度) 四水平 (成活率、攝食率、體長增長率、特定生長率)的Box-Benhnken實驗設計，因子水平分別編碼為?1、0、1，共17個實驗點，每個實驗點重復3次，每個實驗點30尾幼魚，實驗周期為45 d。

1.6 鹽堿耐受實驗設計

采用單因子靜態(tài)急性毒性實驗法[15]進行鹽堿耐受實驗，實驗用魚先參照多因素實驗結(jié)果篩選出的模型優(yōu)化因素條件進行飼養(yǎng)，飼養(yǎng)周期為45 d。飼養(yǎng)周期結(jié)束后，挑選體質(zhì)活躍、無傷無病的幼魚進行鹽堿耐受能力研究并進行預實驗，獲得幼魚24 h全部死亡鹽度、堿度最低濃度和96 h全部成活鹽度、堿度最高濃度。設置7個鹽度梯度 (2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5)和7個堿度濃度梯度 (65、75、85、95、105、115、125 mmol·L?1)，每個濃度梯度設置3個平行組和1個對照組，每組20尾幼魚。為保證實驗過程中溶液濃度的穩(wěn)定性和水質(zhì)清澈，所有濃度梯度24 h更換10%水量，不投餌，實驗分別使用鹽度計和酸度計測定及校準鹽度和堿度。實驗進行96 h，連續(xù)觀察記錄前12 h魚在實驗中的表現(xiàn)情況并記錄24、48、72、96 h的死亡數(shù)，及時撈出死亡 (不能游動和鰓蓋未能煽動) 個體。

1.7 數(shù)據(jù)處理

實驗開始前和實驗結(jié)束后停食1 d，分別測量各組實驗魚的體長、體質(zhì)量，計算成活率 (Survival rate, SR, %)、攝食率 (Feeding ratio, FR, %)、體長增長率 (Length growth rate, LR, %)、特定生長率 (Specific growth rate, SGR, %·d?1) 等指標：

式中：N0為實驗開始時魚的尾數(shù)；Nt為實驗結(jié)束時魚的尾數(shù)；F為飼料攝入量 (g)；t為養(yǎng)殖天數(shù) (d)；W0為實驗開始時魚體質(zhì)量 (g)；Wt為實驗結(jié)束時魚體質(zhì)量 (g)；L0為實驗開始時魚體長 (mm)；Lt為實驗結(jié)束時魚體長 (mm)。

心理健康課程并不僅僅是把基本的理論知識傳遞給學生，更是要讓學生通過多樣化的課程方法做好心理調(diào)節(jié)。因此，在進行課程安排時，也要按照這兩部分來展開。首先，在理論知識普及部分，教師要利用多樣化的授課方式讓學生融入心理課程中。其次，通過理論知識學習后，教師要讓學生進行有效的運用。例如，某校為了充分讓學生掌握心理健康課程，發(fā)揮心理健康的作用，開展了“我是心理醫(yī)生”的角色扮演活動，通過讓學生對有心理問題的案例進行分析與“治療”，利于增強學生的學習自信心，并培養(yǎng)其良好的心理素養(yǎng)。

鹽堿耐受單一因素實驗結(jié)果采用改良寇氏法[16]，分析計算半致死濃度 (LC50) 及95%置信區(qū)間：

式中：Xm為最高濃度對數(shù)；d為濃度對數(shù)差；pi為死亡率；n為實驗動物數(shù)；SD為標準差。

安全濃度 (Safe concentration, SC, %) 采用魚類急性毒性實驗經(jīng)驗公式[17]估算：

實驗數(shù)據(jù)采用 Excel 2020和 SPSS 26.0軟件進行處理和分析，通過Origin 2019軟件繪圖，多因素調(diào)控實驗采用 Design Expert 12進行設計。

2 結(jié)果

2.1 水溫、光周期和光照強度對塔里木裂腹魚幼魚存活、攝食和生長的影響

在為期 45 d 的生長實驗中 (表 1)，0 L∶24 D實驗組幼魚在實驗開始后10 d內(nèi)全部死亡，故未統(tǒng)計其最終體長與體質(zhì)量。結(jié)果 (圖1-a) 顯示，塔里木裂腹魚幼魚適應水溫范圍較大，水溫為5～25 ℃時幼魚成活率均在85%以上，但水溫超過25 ℃時其成活率顯著下降，30 ℃時成活率為46.7%；幼魚在水溫5～20 ℃中攝食率隨著水溫上升而提高，水溫20 ℃時達到最高 (1.96%)，在水溫25～30 ℃中攝食率隨水溫上升而下降 (最低為0.53%)；體長和特定生長率與幼魚攝食率變化趨勢相同，20 ℃ 時達到最高 (22.34% 和 1.58%?d?1)，30 ℃ 時較低 (5.56% 和 0.23%?d?1)。

表1 各實驗組塔里木裂腹魚幼魚的初始和最終體長及體質(zhì)量Table 1 Initial and final body length and body mass of S. biddulphi juveniles in different groupsN=1 440

全黑 (0 L∶24 D) 實驗組的幼魚在 10 d 內(nèi)全部死亡。幼魚成活率、攝食率、體長增長率和特定生長率隨著光照時間的延長而增加，每天光照時間為16 h時各水平達到最高，但每天光照時間為24 h時，成活率、攝食率、體長增長率和特定生長率均下降 (圖 1-b)。

本實驗結(jié)果顯示，塔里木裂腹魚幼魚適應光照強度范圍較大 (圖 1-c)。光照強度為 10～2 000 lx 時幼魚成活率均在80%以上。光照強度較大時幼魚進食活動減少，光照強度為500 lx時幼魚攝食率達到最高 (1.89%)；光照強度小于500 lx時攝食率隨著光照強度降低而減少，其體長增長率和特定生長率與攝食率變化趨勢一致，均在500 lx時達到最高(25.31% 和 1.65%?d?1)。

圖1 水溫、光周期和光照強度對塔里木裂腹魚幼魚成活率、攝食率、體長增長率和特定生長率影響Figure 1 Effects of water temperature, photoperiod and light intensity on survival rate, feeding rate,length growth rate, specific growth rate of S. biddulphi juveniles

2.2 多因素調(diào)控實驗

選擇水溫 (Water temperature, WT)、光照時間(Illumination time, IT, h) 和光照強度 (Light intensity,LI) 為復合調(diào)控因素進行響應面實驗分析 (表2)。根據(jù)實驗結(jié)果建立塔里木裂腹魚幼魚SR、FR、LR 和 SGR 與水溫 (A)、光照時間 (B) 和光照強度(C) 因素之間的多元線性回歸方程：

表2 響應面實驗方案及結(jié)果Table 2 Response surface design and results

4組回歸模型的決定系數(shù)R2均大于0.90，表明實驗誤差較??；四組模擬失效項P分別為0.07、0.40、0.83、0.95，均大于0.05，說明模型有效，可以很好地分析和預測3種環(huán)境因子對塔里木裂腹魚存活、攝食和生長的影響[18]。

由表 3可見，一次項水溫 (A)、光照時間 (B) 對SR、FR、LR、SGR影響均顯著 (P<0.05)，一次項(C) 僅對FR影響顯著；交互項AB對SR、FR影響顯著 (P<0.05)，AC、BC對 FR 影響顯著 (P<0.05)；二次項A2、B2對SR、FR、LR、SGR影響均極顯著(P<0.01)，C2對 FR、LR、SGR 影響顯著 (P<0.05)。

表3 各因素及其交互作用對塔里木裂腹魚幼魚成活率、攝食率、體長增長率和特定生長率的顯著性檢驗Table 3 Significance test of factors and their interactions on survival rate, feeding rate, length growth rate and specific growth rate of S. biddulphi juveniles

水溫、光照時間和光照強度對SR、FR、LR、SGR調(diào)控的響應面分析結(jié)果 (圖2) 顯示，水溫和光照時間、水溫和光照強度、光照時間和光照強度對響應值的交互作用均呈現(xiàn)開口向下的山丘狀，于底面投影等高線呈橢圓形，因此各環(huán)境因子之間的交互作用均對塔里木裂腹魚存活、攝食、生長影響顯著。本實驗響應模型優(yōu)化結(jié)果顯示，水溫12.98 ℃、每天光照時間15.07 h、光照強度670.27 lx時可獲得塔里木裂腹魚的最佳存活、攝食和生長條件，此時理論成活率為81.61%，理論攝食率為1.53%，理論體長增長率為16.34%，理論特定生長率為1.13%?d?1。經(jīng)驗證，最佳環(huán)境條件下塔里木裂腹魚成活率為82.22%，攝食率為1.49%，體長增長率為16.21%，特定生長率為1.07%?d?1，該結(jié)果與理論值基本相符，說明響應模型可有效預測塔里木裂腹魚的存活、攝食和生長狀況。

圖2 水溫、光照時間和光照強度對塔里木裂腹魚幼魚成活率、攝食率、體長增長率和特定生長率的響應面a. 水溫和光照時間對成活率的影響；b. 水溫和光照強度對成活率的影響；c. 光照時間和光照強度對成活率的影響；d. 水溫和光照時間對攝食率的影響；e. 水溫和光照強度對攝食率的影響；f. 光照時間和光照強度對攝食率的影響；g. 水溫和光照時間對體長增長率的影響；h. 水溫和光照強度對體長增長率的影響；i. 光照時間和光照強度對體長增長率的影響；j. 水溫和光照時間對特定生長率的影響；k. 水溫和光照強度對特定生長率的影響；l. 光照時間和光照強度對特定生長率的影響。Figure 2 Response surface and contour plot of effects of water temperature, illumination time and light intensity on survival rate,feeding rate, length growth rate, specific growth rate of S.biddulphi juvenilesa. Influence of WT and IT on SR; b. Influence of WT and LI on SR; c. Influence of IT and LI on SR; d. Influence of WT and IT on FR; e. Influence of WT and LI on FR; f. Influence of IT and LI on FR; g. Influence of WT and IT on LR; h. Influence of WT and LI on LR; i. Influence of IT and LI on LR; j. Influence of WT and IT on SGR; k. Influence of WT and LI on SGR; l. Influence of IT and LI on SGR.

2.3 鹽堿耐受能力

塔里木裂腹魚幼魚在不同鹽度下的累計死亡率見表4。實驗過程中，對照組中幼魚的行為始終正常，無死亡個體，水質(zhì)清澈無雜質(zhì)。在不同鹽度耐受性實驗組中，幼魚反應強烈，鰓蓋活動頻率加快。幼魚開始死亡的時間為第10小時 (鹽度為4.0)，死亡時幼魚停止游動，體表無光澤 (圖3-a)。

表4 不同鹽度條件下塔里木裂腹魚幼魚的死亡率Table 4 Lathal rate of S. biddulphi juveniles at different salinitiesN=560

塔里木裂腹魚幼魚的死亡率隨著時間延長、堿度增加而增大 (表5)。實驗過程中，對照組中幼魚未出現(xiàn)死亡，水質(zhì)始終保持清澈。幼魚在12 h堿度 85 mmol·L?1時未出現(xiàn)死亡，堿度為 105 mmol·L?1時死亡率達46.67%，第72小時全部死亡。死亡個體眼睛充血，腹部充滿腹水 (圖3-b)。

圖3 塔里木裂腹魚幼魚鹽中毒 (a) 和堿中毒 (b)Figure 3 Salt poisoning (a) and alkali poisoning (b) of S. biddulphi juveniles

表5 不同堿度條件下塔里木裂腹魚幼魚的死亡率Table 5 Lathal rate of S. biddulphi juveniles at different alkalinitiesN=560

塔里木裂腹魚幼魚24、48、72和96 h鹽度LC50分別為 4.01、3.62、3.29和 2.92 g·L?1，SC為 0.89 g·L?1；24、48、72和 96 h 堿度 LC50為 97.14、86.75、80.26和 74.52 mmol·L?1，SC為20.75 mmol·L?1(表 6)。

表6 塔里木裂腹魚幼魚的急性鹽度和堿度半致死濃度Table 6 Acute LC50 of S. biddulphi juveniles at different salinities and alkalinities

3 討論

在養(yǎng)殖過程中，幼魚對環(huán)境因子的變化非常敏感[19]。其中水溫是一個重要的環(huán)境因子，它可以通過改變幼魚體內(nèi)酶的活性，調(diào)節(jié)代謝過程中的能量收支，直接影響幼魚的發(fā)育和存活[20]。本實驗中，水溫低于25 ℃時各組成活率差異不顯著 (P>0.05)；水溫高于25 ℃時各組成活率急劇下降。這與曾本和等[21]異齒裂腹魚 (S. oconnori) 的研究結(jié)果相似，可能是因為塔里木裂腹魚和異齒裂腹魚長期生活在高海拔地區(qū)，水溫較低，魚體為適應環(huán)境產(chǎn)生了耐低溫的能力。

魚類攝食率是決定其生長的重要因素之一[22]。本實驗中，隨著水溫的升高，塔里木裂腹魚幼魚的攝食率呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，其體長增長率和特定生長率與幼魚攝食率變化一致，這與胡發(fā)文等[23]對大瀧六線魚 (Hexagrammos otakii)，牟振波等[24]對細鱗魚 (Brachymystax lenok) 的研究結(jié)果一致。本實驗中，塔里木裂腹魚幼魚在水溫20 ℃時攝食率達最高，與異齒裂腹魚[21]、細鱗魚[24]等冷水魚相似。

光周期與晝夜更替信號，刺激生物體內(nèi)節(jié)律調(diào)節(jié)系統(tǒng)和外界環(huán)境保持一致[25]。本實驗中，光照時間對塔里木裂腹魚的生長和存活有一定影響。幼魚是視覺性攝食動物，依靠光照產(chǎn)生視覺反應而進行攝食[26]，本研究中全黑實驗組因無光照，幼魚不能進行正常攝食，最終在10 d內(nèi)全部死亡；幼魚成活率、攝食率、體長增長率和特定生長率在8 L∶16 D、12 L∶12 D、16 L∶8 D 和 24 L∶0 D 組之間均差異顯著 (P<0.05)，這與對克氏雙鋸魚 (Amphiprion clarkii)[27]、?？p鋸魚 (A. percula)[28]的研究結(jié)果存在差異，可能是因為塔里木裂腹魚生活在青藏高原上，海拔高、光照時間長，其幼魚適應了長光照環(huán)境。

本研究中，光照強度達到500 lx時塔里木裂腹魚幼魚成活率、攝食率、體長增長率和特定生長率均最大，而光照強度低于500 lx時，其成活率、攝食率和生長率開始下降，反映光照強度對其存活、攝食和生長具有重要影響。筆者在克孜勒河進行為期2個月的野外捕撈，發(fā)現(xiàn)塔里木裂腹魚幼魚喜在太陽初升或黃昏時段于淺水區(qū)域進行攝食，沒有被驚擾時喜在陽光直射的中下水層聚集，這與本實驗結(jié)果一致。尖齒胡鯰 (Clarias gariepiinus) 在 0 lx 時獲得較快生長速度[29]；豹紋鰓刺鱸 (Plectropomus leopardus) 幼魚在 3 000 lx光照條件下存活和生長也可達到較好水平[30]；克氏雙鋸魚仔魚發(fā)育則需要較弱光照強度 (100～1 000 lx)[27]。不同魚類對光照需求不同，光照對魚類生長的影響機制有待進一步研究。

多因素實驗結(jié)果顯示，塔里木裂腹魚最佳存活、攝食、生長條件為水溫12.98 ℃、每天光照時間15.07 h、光照強度670.27 lx，推斷其幼魚適宜在擁有低溫水源、長光照時間的區(qū)域進行規(guī)?；B(yǎng)殖，中國青藏高原及中國東北地區(qū)可滿足塔里木裂腹魚的大規(guī)模苗種培育工作。

鹽度可以通過影響魚類體內(nèi)滲透壓來干擾魚類的正常生理活動[31-32]。大部分魚類可以通過魚鰓上三磷酸腺苷酶 (ATP酶)為離子轉(zhuǎn)運提供載體和驅(qū)動力，從而平衡滲透壓，其中Na+/K-ATPase可將K+向胞內(nèi)運輸?shù)耐瑫r向胞外排出Na+，使胞內(nèi)Na+維持在一定水平[33-35]。本研究中，隨著鹽度的升高，4種裂腹魚幼魚的死亡率也隨之升高，96 h后無幼魚存活。裂腹魚幼魚從低滲環(huán)境轉(zhuǎn)變到高滲環(huán)境中，魚鰓的結(jié)構(gòu)和生理機能會發(fā)生明顯改變，魚鰓上Na+/K-ATPase活性受到抑制，K+/Na+與外界交換受阻，從而造成細胞損傷和魚類死亡[36-37]。

不同研究中的實驗條件和魚類規(guī)格有所差異，但簡單地將不同淡水魚類鹽堿耐受能力進行比較后發(fā)現(xiàn)，塔里木裂腹魚幼魚耐鹽堿能力較差，耐堿能力低于大鱗鲃 (Barbus capito)[41]、青海湖裸鯉(Gymnocypris przewalskii)[42]，與黑龍江泥鰍 (Misgurnus mohoity)[43]、灘頭雅羅魚 (Tribolodon brandti)[44]耐堿能力相近；耐鹽能力低于松浦鏡鯉(Cyprinus carpio songpu)[41]、歐鲇 (Silurus glanis)[45]、黃鱔 (Monopterus albus)[46]等。推測可能是由于實驗用魚體型偏小，魚體內(nèi)鹽堿緩沖體系尚未發(fā)育完善，導致其耐鹽堿能力較差；另外，本實驗用水為新疆南疆地區(qū)地下水，水質(zhì)偏堿性且鹽度較高，也可能造成所測幼魚的鹽堿耐受能力偏弱。