鄭桂花，李世堯，張 婷，崔 雄，張文浩，孫 靜，邱 誠

（1.成都工業(yè)學(xué)院材料與環(huán)境工程學(xué)院，成都 611730；2.華中科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，武漢 430074）

氨基酸分離方法主要有沉淀劑分離法、離子交換法、膜分離法、吸附法、萃取法等。沉淀法包括特殊試劑沉淀法、等電點沉淀法和有機溶劑沉淀法。特殊試劑沉淀法是最早應(yīng)用于混合氨基酸分離的方法之一，精氨酸和亮氨酸的特殊沉淀法分離工藝已較為成熟［1］。沉淀法具有簡單、方便、經(jīng)濟和濃縮倍數(shù)高、選擇性強的優(yōu)點，但是也有沉淀劑回收困難、排放廢液量大、環(huán)境污染嚴重等問題，因此沉淀法已逐漸被其他分離方法取代。吸附法選擇性相對較差、收率低，特別是一些無機吸附劑的性能不穩(wěn)定、不能連續(xù)操作、勞動強度大，尤其是活性炭還影響環(huán)境衛(wèi)生。近年來逐漸發(fā)展的新型分離技術(shù)有超臨界CO2萃取技術(shù)、超濾和納濾技術(shù)以及液膜技術(shù)等，這些新開發(fā)的技術(shù)取得了很大進展，但也存在工藝不夠成熟、設(shè)備精密度不高、難以去除萃取液的毒性、有機溶劑用量大、廢棄溶劑難以回收、生產(chǎn)成本高等諸多問題，在一定程度上限制了其大規(guī)模應(yīng)用。

離子交換法是氨基酸工業(yè)中應(yīng)用比較廣泛的一種分離純化方法，主要根據(jù)離子交換樹脂對不同氨基酸吸附能力的差異實現(xiàn)對混合溶液中氨基酸組分或單一組分的分離。根據(jù)報道，目前已有很多成功運用離子交換方法分離氨基酸的研究，如余諱等［2］采用732陽離子交換樹脂，從發(fā)酵液中分離純化出L-亮氨酸，總提取率達71.28%；Simon等［3，4］利用離子交換熱參數(shù)泵成功從水解液和制革廢液中分離濃縮出氨基酸；此外，應(yīng)用離子交換方法實現(xiàn)分離的氨基酸還有精氨酸（Arg）［5，6］、賴氨酸（Lys）［7］、異亮氨酸（Ile）［8］、酪氨酸（Tyr）［9］、亮氨酸（Leu）［2］、丙氨酸（Ala）［10］、脯氨酸（Pro）［11］、組氨酸（His）［12］、谷氨酸（Glu）［13］、苯丙氨酸（Phe）［1］等。酶法合成L-絲氨酸試驗反應(yīng)結(jié)束后，酶反應(yīng)液中可能含有甘氨酸和L-絲氨酸，由于甘氨酸和絲氨酸性質(zhì)相似，等電點接近，溶解度也相差不大，所以二者一直是氨基酸分離領(lǐng)域的難點，基于離子交換法設(shè)備要求簡單、易于操作、分離成本低廉、處理量大以及便于大規(guī)模進行工業(yè)化生產(chǎn)等諸多優(yōu)勢，本研究選用DIAION PA312陰離子交換樹脂對L-絲氨酸進行分離純化，以期能夠為相關(guān)的實踐提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

DIAION PA312樹脂購于三菱化學(xué)股份有限公司，D301R陰離子交換樹脂和AB-8大孔吸附樹脂均購于天津南開合成科技有限公司，201×7陰離子交換樹脂購于上海勁凱樹脂有限公司，TEA購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司，衍生化試劑PITC（＞98%）購于阿拉丁試劑有限公司，乙腈和甲醇由美國Tedia試劑公司生產(chǎn)，甲酸（98%～100%）來自天津光復(fù)精細化工研究所。除甲醇和乙腈為色譜純外，其余試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；Agilent 1200譜作站，美國安捷倫科技公司；YM-50高壓蒸汽滅菌鍋，上海三申醫(yī)療器械有限公司；ZHWY-2102恒溫培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器有限公司；DZF-6020MBE真空干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；101A-1BY鼓風(fēng)恒溫干燥箱，杭州藍天化驗儀器有限公司；SHB-3循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；Agilent Eclipse plus C18色譜柱，美國Sigma-Aldrich公司；Agilent1100LC/MSD液質(zhì)聯(lián)用儀，美國安捷倫科技公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 離子交換樹脂的預(yù)處理

1）大孔吸附性樹脂的預(yù)處理：將樹脂除雜、過篩，用一定量去離子水漂洗除去浮粒；然后用95%乙醇浸泡24 h，再用小流量去離子水淋洗，洗至流出液不渾濁為止；最后用2～3倍樹脂體積的1 mol/L HCl溶液浸泡3 h，水洗至流出液接近中性，再用2～4倍樹脂體積的2 mol/L NaOH溶液浸泡3 h，去離子水洗至中性。

2）陰離子交換樹脂的預(yù)處理：先用自來水浸泡2 h，使其充分膨脹，去除樹脂中的細小顆粒，用去離子水洗至pH為5～6；然后用2 mol/L NaOH溶液浸泡6 h，用去離子水洗去堿液至pH為7.0；再用2 mol/L的HCl溶液連續(xù)浸泡6 h，用去離子水洗去酸液至pH為5.5±0.5；最后再次用2 mol/L NaOH溶液轉(zhuǎn)型處理浸泡6 h，用去離子水洗至pH為7.0，以備使用。

1.3.2 吸附量、吸附率及L-絲氨酸含量的測定方法

1）吸附量和吸附率的測定：準確稱取已經(jīng)處理好的201×7、AB-8、D301R、DAION PA312樹脂各2 g，置于150 mL的三角瓶中，依次加入20 mL的濃度為10 g/L的L-絲氨酸溶液，于30℃，100 r/min的恒溫搖床中連續(xù)振蕩7 h，比較這4種樹脂的靜態(tài)吸附容量。離子交換樹脂的吸附量即交換容量，樹脂吸附量與吸附率均是評價樹脂性能的重要指標(biāo)，吸附量及吸附率公式表示如下：

其中，Q為吸附達到平衡時的樹脂吸附量（mg/g）；E為吸附達到平衡時的樹脂吸附率（%）；C0為吸附前溶液的濃度（g/L）；C為吸附平衡后溶液的濃度（g/L）；V為溶液體積（L）；W為樹脂的質(zhì)量（g）。

2）L-絲氨酸含量的測定：首先對含有氨基酸的洗脫溶液進行預(yù)處理，然后采用異硫氰酸苯酯衍生化處理，最后用HPLC-ESI-MS測定氨基酸含量［14］。

1.3.3 離子交換樹脂靜態(tài)交換吸附方法

1）吸附時間對吸附效果的影響：量取2 mL濕樹脂于50 mL三角瓶中，加入50 mL已經(jīng)處理好的酶促轉(zhuǎn)化溶液，放入30℃，100 r/min搖床中振蕩一定的時間，每10 min取樣一次，每次取樣10μL，連續(xù)取樣2 h，取樣之后對樣品進行衍生化處理，待樣品處理好后進行HPLC分析。

2）上樣溶液pH對吸附效果的影響：準確量取8份25 mL濃度為10 mmol/L處理好的酶促轉(zhuǎn)化溶液于250 mL三角瓶中，調(diào)節(jié)樣品溶液的pH，分別使其pH為4、5、6、7、8、9、10、11，每份溶液加入1 mL樹脂，放入30℃，100 r/min搖床中連續(xù)振蕩一定的時間，保持樹脂吸附20 min，取樣量為10μL，每組取3個平行樣。

3）樹脂實際交換量的確定：取10 mol/L已經(jīng)處理好的酶促轉(zhuǎn)化溶液140 mL，調(diào)節(jié)溶液pH至9，加入到250 mL三角瓶中，置于30℃，100 r/min的搖床中連續(xù)振蕩吸附一定時間，每組取3個平行樣。

1.3.4 離子交換樹脂動態(tài)交換吸附方法

1）洗脫劑類型對洗脫效果的影響：裝好層析小柱和樹脂，加入pH為9的酶促轉(zhuǎn)化混合溶液，采用0.2 mol/L茚三酮檢測流出液，直到流出液遇茚三酮變紫色時停止上樣，保持吸附20 min，去離子水淋洗樹脂至流出液pH至7左右，分別采用0.2 mol/L PBS（pH=5）和0.8 mol/L HCl溶液作為洗脫劑，每1 mL收集一次流出液，連續(xù)收集30 mL，取10μL做衍生化處理，待樣品處理好后進行HPLC分析。

2）洗脫流速對洗脫效果的影響：將適量的濕樹脂裝入層析柱，緩慢滴加pH為9的酶促轉(zhuǎn)化混合溶液20 mL，用茚三酮檢測流出液，直到流出液遇茚三酮變紫色時停止上樣，保持吸附20 min，去離子水淋洗樹脂至流出液pH至7左右，以0.2 mol/L PBS（pH=5）作為洗脫液，分別考察0.3、0.4、0.5 mL/min流速對洗脫效果的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 離子交換樹脂的選擇

由圖1可知，DAION PA312陰離子交換樹脂在4.5 h時吸附達到飽和且吸附量相對較大，而AB-8、D301R、201×7樹脂在4.5 h時還未到達飽和，吸附平衡時間較長，通過對比發(fā)現(xiàn)DAION PA312陰離子交換樹脂到達平衡時間相對較快，更利于工業(yè)化快速操作，所以選擇DAION PA312陰離子交換樹脂為提取純化L-絲氨酸的最佳樹脂。

圖1 不同樹脂對L-絲氨酸的靜態(tài)吸附曲線

2.2 吸附時間對吸附效果的影響

由表2可知，隨著吸附時間的延長，樹脂吸附L-絲氨酸的量逐漸增大，10～20 min時樹脂吸附氨基酸的量快速增加，20 min時吸附達到飽和，吸附的L-絲氨酸量為25.07 mg/g；吸附率和吸附L-絲氨酸的量呈現(xiàn)相同的趨勢，隨著吸附時間的增加，樹脂的吸附量變化不大，因此，選擇20 min為樣品上柱后的最佳吸附時間。

圖2 吸附時間對吸附效果的影響

2.3 上樣溶液pH對吸附效果的影響

由圖3可知，樣品溶液的pH為4～9時，樹脂吸附氨基酸的量整體上呈增加的趨勢，吸附率保持持續(xù)增加趨勢，pH為9時，樹脂吸附L-絲氨酸的量及吸附率均達到最大值，當(dāng)pH為9～11時，相應(yīng)的吸附量和吸附率逐漸下降，因此樣品溶液最適合pH為9。

圖3 上樣溶液pH對吸附效果的影響

2.4 樹脂實際交換容量的確定

由圖4可知，樹脂連續(xù)吸附20 min時，吸附L-絲氨酸的量及相應(yīng)的吸附率一直保持增加的趨勢，20 min后，樹脂吸附L-絲氨酸增加趨勢放緩，基本達到飽和，吸附率基本不再增加，樹脂吸附L-絲氨酸的量約為94.25 mg/g，因此，DAION PA312陰離子交換樹脂的實際交換容量為94.25 mg/g。

圖4 樹脂的實際交換容量

2.5 洗脫劑類型對洗脫效果的影響

由圖5可知，采用0.2 mol/L PBS（pH=5）作為洗脫劑可以將絲氨酸和甘氨酸有效地分離并快速地洗脫下來，整個洗脫過程大約需要35 min，而采用0.8 mol/L HCl作為洗脫溶劑時，分離不夠徹底，洗脫時間相對較長，洗脫曲線有拖尾現(xiàn)象。

圖5 洗脫劑類型對洗脫效果的影響

2.6 洗脫流速對洗脫效果的影響

由圖6可知，洗脫峰主要集中在2～18 min，隨著洗脫速度的逐漸增大，洗脫曲線逐漸收斂，洗脫效果明顯變好。洗脫速度為0.5 mL/min時，洗脫曲線有明顯的拖尾現(xiàn)象，此條件下L-絲氨酸的收率較低；洗脫流速為0.4 mL/min時，洗脫過程進行相對較快，無拖尾現(xiàn)象；洗脫流速為0.3 mL/min時，洗脫劑流速較慢容易導(dǎo)致結(jié)柱現(xiàn)象，洗脫周期較長。綜合考慮以上因素，選擇0.4 mL/min為最佳的離子交換洗脫流速。

圖6 洗脫流速對洗脫效果的影響

4 小結(jié)

本研究采用離子交換法對酶促轉(zhuǎn)化合成的產(chǎn)物L(fēng)-絲氨酸進行提取純化，通過對比4種不同離子交換樹脂的靜態(tài)吸附容量，確定選擇強堿性陰離子交換樹脂DAION PA312作為提取純化L-絲氨酸最佳樹脂，該樹脂具有分離范圍廣，可以與各種無機鹽及無機酸發(fā)生離子交換，樹脂活化、再生方法簡單等優(yōu)點。通過對分離純化各個階段的L-絲氨酸含量進行定量分析，確定了最佳的吸附和脫附工藝條件，即吸附條件：上樣溶液pH=9，吸附時間為20 min，實際交換容量為94.25 mg/g；脫附條件：洗脫液為0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH=5），洗脫流速為0.4 mL/min。