隗志松，舒園園，蔡得田，劉育華，王慶飛，王 群，馬雪寒

（武漢多倍體生物科技有限公司，武漢 430300）

水稻（Oryza sativaL.）是一種重要的糧食作物，世界上大概50%以上人口以大米為主食，如中國(guó)、印度、巴基斯坦等［1］。多倍體水稻的研究國(guó)際上可以追溯至1937年［2］，中國(guó)的多倍體水稻育種研究由鮑文奎先生于1953年開(kāi)創(chuàng)［3］。多倍體水稻育種是不同于二倍體水稻育種的一種新型育種途徑，多倍體植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性強(qiáng)，抗旱、抗寒等優(yōu)勢(shì)明顯，僅從地理分布上看，多倍體大多出現(xiàn)在環(huán)境變化劇烈的地區(qū)，說(shuō)明多倍體植物能夠更好地適應(yīng)不利自然條件［4-6］。雖然一些相關(guān)研究取得了進(jìn)展，但是多倍體水稻結(jié)實(shí)率低的問(wèn)題仍沒(méi)有得到實(shí)質(zhì)性突破。多倍體水稻具備增產(chǎn)潛力大和抗逆性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，但結(jié)實(shí)率低一直制約著其發(fā)展。因多倍化伴隨著基因劑量的成倍增加，減數(shù)分裂的控制機(jī)制變得異常復(fù)雜，導(dǎo)致水稻花粉發(fā)育模式和種子早期發(fā)育的改變，絕大多數(shù)多倍體水稻花粉嚴(yán)重?cái)∮医Y(jié)實(shí)率低，制約多倍體水稻育種研究的發(fā)展進(jìn)程。多倍體水稻關(guān)鍵種質(zhì)減數(shù)分裂穩(wěn)定品系PMeS的成功選育為多倍體水稻育種提供了種質(zhì)，同時(shí)也突破了多倍體水稻低結(jié)實(shí)的瓶頸［7］。

蔡得田教授與袁隆平院士、盧興桂研究員得益于自然界的重要啟示，共同提出了“利用遠(yuǎn)緣雜交和多倍體雙重優(yōu)勢(shì)選育超級(jí)稻”的新思路［4］。該育種思路與常規(guī)育種相比具備遠(yuǎn)緣雜種和多倍體雜種的雙重優(yōu)勢(shì)，理論上可以帶來(lái)產(chǎn)量的大幅增加。多倍體水稻關(guān)鍵種質(zhì)減數(shù)分裂穩(wěn)定品系PMeS的成功選育是多倍體水稻育種過(guò)程中的重要突破，為多倍體水稻育種提供了關(guān)鍵種質(zhì)。但目前，關(guān)于其高結(jié)實(shí)機(jī)制的研究還有待進(jìn)一步深入開(kāi)展，解析關(guān)鍵種質(zhì)PMeS的高結(jié)實(shí)特性，選育優(yōu)良的高結(jié)實(shí)多倍體水稻品系，并將其運(yùn)用于育種實(shí)踐是使多倍體水稻造福于人類(lèi)的根本性育種策略。

多倍體水稻育種經(jīng)過(guò)多年的科研積累已經(jīng)取得了一系列的成果，如湖北省重大科技成果（EK040192）和十余項(xiàng)發(fā)明專(zhuān)利。水稻遠(yuǎn)緣雜交和多倍化后染色體數(shù)目成倍增加，遺傳背景復(fù)雜且基因重組類(lèi)型多，性狀穩(wěn)定慢，育種年限拉長(zhǎng)，因此迫切需要利用現(xiàn)代細(xì)胞工程、基因工程等技術(shù)的協(xié)同攻關(guān)［8，9］。智能育種工廠可以模擬大自然環(huán)境，縮短水稻的基本營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)間，使其快速進(jìn)入生殖生長(zhǎng)階段，在室內(nèi)進(jìn)行全生育期的加代快繁，改變目前包括南繁在內(nèi)的一年只能繁殖兩代的育種現(xiàn)狀。在智能育種工廠里能實(shí)現(xiàn)從種子到種子，每年可實(shí)現(xiàn)3～4代的快速繁殖，縮短育種周期；并在單倍體快速加代穩(wěn)定的同時(shí)，結(jié)合基因芯片進(jìn)行基因檢測(cè)、靶向定位、高通量分子標(biāo)記等高科技育種輔助手段，在智能育種工廠里淘汰含不良性狀的單株，保留含優(yōu)良性狀的單株移栽到大田進(jìn)行擴(kuò)繁和鑒定，最終選育出符合育種目標(biāo)的品種。

為了加快多倍體水稻的育種進(jìn)程，武漢多倍體生物科技有限公司于2019年初新建了多倍體水稻全生育期智能育種工廠（PGBS），承建單位為武漢雙綠源創(chuàng)芯科技研究院有限公司，并于同年6月正式投入使用。經(jīng)近2年的使用，育種工廠主要作用于加代快繁、組織培養(yǎng)、抗性改良等幾個(gè)方面。多倍體水稻育種不同于二倍體水稻，四倍體水稻有四套染色體組，因其遺傳與分離的復(fù)雜性，需要長(zhǎng)時(shí)間才能穩(wěn)定。在自然條件下一年兩代的繁殖速度遠(yuǎn)不能滿足多倍體水稻的育種需求，而在智能育種工廠里一年3～4代的繁殖速度加快了多倍體水稻的育種進(jìn)程；優(yōu)異種質(zhì)資源是多倍體水稻育種的基礎(chǔ)，在利用組培技術(shù)創(chuàng)制多倍體水稻種質(zhì)資源過(guò)程中倍性檢測(cè)是必不可少的重要環(huán)節(jié)，利用智能育種工廠進(jìn)行多倍體水稻的形態(tài)學(xué)檢測(cè)可免受氣候及區(qū)域的限制；另外，在多倍體水稻材料的雜交改良、分子輔助選擇育種以及四倍體恢復(fù)二倍體水稻的培養(yǎng)中智能育種工廠都有重要作用。多倍體水稻全生育期智能育種工廠的合理應(yīng)用勢(shì)必加快多倍體水稻的育種進(jìn)程。

1 智能育種工廠的基礎(chǔ)設(shè)備

智能育種工廠的LED燈光可以對(duì)光譜進(jìn)行精準(zhǔn)的控制，模擬自然光。依據(jù)三色調(diào)色原理，通過(guò)LED光源陣列進(jìn)行不同光譜的混合，模擬出不同的光譜，滿足不同植物的生長(zhǎng)需求。智能育種工廠的LED植物光照系統(tǒng)的光照度可以達(dá)到1 800μmol/（m2·s）（光量子通量密度），能夠滿足幾乎所有植物生長(zhǎng)的需求［夏季光照度一般為1 800μmol/（m2·s）左右，中午為2 550μmol/（m2·s）左右］。LED燈光屬于冷光源，其釋放的熱量比高壓鈉燈少很多，可以在很小的空間范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)溫度的精準(zhǔn)控制。LED燈光使用壽命長(zhǎng)，光衰慢，使用5年都不需要更換，且光強(qiáng)幾乎不會(huì)減弱。

智能育種工廠可以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的環(huán)境控制：智能育種工廠通過(guò)中央控制系統(tǒng)對(duì)環(huán)境做到精準(zhǔn)控制；控制器通過(guò)采集傳感器信號(hào)和設(shè)定值進(jìn)行比對(duì)，通過(guò)PID+PWM輸出自動(dòng)調(diào)節(jié)加熱功率或制冷劑流量，使設(shè)備箱內(nèi)的空氣溫濕度達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡；可以按照用戶的需求設(shè)計(jì)溫度和濕度的控制范圍，溫度控制精度為±1℃，濕度控制精度為±5%～8%（RH）。采用暗藏式空氣處理機(jī)組，設(shè)計(jì)采用管道分區(qū)域定點(diǎn)送回風(fēng)方式，可以保證各區(qū)域的溫濕度同時(shí)達(dá)到所設(shè)定參數(shù)，并且升降溫過(guò)程平穩(wěn)，無(wú)明顯過(guò)沖現(xiàn)象。模擬自然界溫濕度變化，氣流分布均勻，溫濕度場(chǎng)合理。新風(fēng)和循環(huán)風(fēng)同時(shí)并行，既保證足量的新風(fēng)和CO2濃度，又可以循環(huán)利用，節(jié)約能源。智能控制系統(tǒng)有溫濕度、光照等參數(shù)實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)顯示功能，為了保證歷史數(shù)據(jù)安全性，該系統(tǒng)具有歷史數(shù)據(jù)儲(chǔ)存功能，同時(shí)能通過(guò)USB接口將歷史數(shù)據(jù)導(dǎo)出，可保存半年的相關(guān)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，便于追溯和重復(fù)。

目前，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院、中國(guó)科技大學(xué)以及航天登月工程中，利用智能育種工廠在密封的空間培育出各種蔬菜。研究者可以利用智能育種工廠輔助選育出符合生產(chǎn)應(yīng)用的優(yōu)良水稻品種進(jìn)行推廣，為農(nóng)民和國(guó)家增收、增益。

2 智能育種工廠在多倍體水稻加代快繁中的應(yīng)用

在二倍體水稻的育種過(guò)程中，需要5～8代的系統(tǒng)選育，選育品種才會(huì)趨于穩(wěn)定［10，11］。四倍體水稻有四套染色體，因其遺傳與分離的復(fù)雜性，其難以像二倍體水稻那樣經(jīng)過(guò)幾年的加代即可基本穩(wěn)定，往往需要種植幾十代才能穩(wěn)定［12］。受自然條件限制，在湖北省農(nóng)作物每年只能種植一代，多倍體水稻新品種的選育周期長(zhǎng)，南繁即使一年兩代的種植對(duì)于多倍體水稻的育種進(jìn)程來(lái)說(shuō)都是緩慢的，全生育期水稻智能育種工廠的建設(shè)正好解決了該問(wèn)題［13］。智能育種工廠通過(guò)對(duì)光譜、光照度、光照時(shí)長(zhǎng)、溫度、濕度、CO2濃度的調(diào)節(jié)，從而能縮短水稻的整個(gè)生長(zhǎng)周期。

2.1 智能育種工廠二倍體和四倍體水稻全生育期比較

2.1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)品種（品系）：二倍體秈稻有豐兩優(yōu)四號(hào)、野香優(yōu)莉絲、Y兩優(yōu)多回14；二倍體粳稻有南粳46、龍粳31、RBD-1；四倍體秈稻有A3、T7、17HD391；四倍體秈稻有DBT01、DBT02、DBT03。

2.1.2 試驗(yàn)方法

1）自播種開(kāi)始前20 d為長(zhǎng)日照處理。光照處理12 h，溫度32℃，濕度70%，CO2濃度450 cm2/m3；暗處理12 h，溫度27℃，濕度50%，CO2濃度350 cm2/m3。

2）第21天至成熟為短日照處理。光照處理10 h，溫度32℃，濕度60%，CO2濃度450 cm2/m3；暗處理14 h，溫度27℃，濕度40%，CO2濃度350 cm2/m3。

3）播種后一個(gè)月施肥一次。試驗(yàn)所使用的為32孔穴盤(pán)，每穴盤(pán)施10 g水溶肥。水溶肥的成分及含量為N 20%、P 10%、K 20%、Cu 0.05%、Zn 0.1%、Fe 0.1%、Mn 0.1%。全生育過(guò)程保證穴盤(pán)不缺水。

2.1.3 結(jié)果與分析 表1為水稻品種（品系）在智能育種工廠與田間種植的全生育期比較。從表1可以看出，在智能育種工廠里種植的水稻全生育期相對(duì)于田間種植都有明顯縮短，縮短幅度在1.4%～38.0%；如果按照智能育種工廠中的水稻全生育期計(jì)算，理論上可以實(shí)現(xiàn)一年3～4代的快繁體系建設(shè)，而且粳稻的效果好于秈稻。

表1 水稻品種（品系）在智能育種工廠與田間種植的全生育期比較

2.2 智能育種工廠在多倍體水稻組織培養(yǎng)中的應(yīng)用

2.2.1 形態(tài)學(xué)倍性鑒定 多倍體水稻種質(zhì)資源的創(chuàng)制是多倍體水稻育種的物質(zhì)基礎(chǔ)，而倍性的鑒定在多倍體水稻新型種質(zhì)資源的創(chuàng)制中是一個(gè)必不可少的環(huán)節(jié)。二倍體水稻經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)愈傷、加倍培養(yǎng)、恢復(fù)培養(yǎng)、分化出苗、生根等一系列的試驗(yàn)過(guò)程創(chuàng)制出的組培苗是否被成功誘導(dǎo)為四倍體水稻，倍性的鑒定是關(guān)鍵一步。當(dāng)季節(jié)不適宜水稻的生長(zhǎng)時(shí)，可以將組培苗移栽至智能育種工廠里進(jìn)行形態(tài)學(xué)的鑒定，并收獲加倍成功的多倍體水稻種子。圖1為編號(hào)2020wzm組培加倍苗在智能育種工廠里的形態(tài)鑒定情況。二倍體水稻在組培加倍后得到的同源（亞同源）四倍體水稻結(jié)實(shí)率降低、子粒增大、有芒，植株較二倍體更高、莖稈更粗、分蘗降低、株形松散。

圖1 2020wzm組培加倍苗形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

2.2.2 花藥組織培養(yǎng) 利用水稻花藥培養(yǎng)可以實(shí)現(xiàn)單倍體育種，也可以嘗試?yán)们锼伤貎纱渭颖兜姆椒焖俚玫郊兒系乃谋扼w水稻［14］。水稻的花藥培養(yǎng)，取材是關(guān)鍵，既要保持花藥新鮮，又要取材時(shí)期恰當(dāng)。武漢市當(dāng)?shù)匾荒暌患镜乃痉N植限制了花藥組織培養(yǎng)的試驗(yàn)進(jìn)程。在智能育種工廠內(nèi)可以實(shí)現(xiàn)一年3～4次的試驗(yàn)取材，且取材方便，加快了試驗(yàn)進(jìn)度。圖2為從智能育種工廠取材的花藥組培。

2.2.3 雜種胚挽救 雜交是常用的一種水稻育種手段，水稻有很多雜種因胚乳未發(fā)育完全以至需要胚挽救；利用普通的浸種方法難以出苗，四倍體水稻雜種更是如此，利用組織培養(yǎng)進(jìn)行胚挽救可以很好地解決這一問(wèn)題。因水稻的雜種有很多褶皺的部分，在組培中很難消毒徹底，這時(shí)會(huì)存在染菌風(fēng)險(xiǎn)，長(zhǎng)出的幼苗一但染菌必須及時(shí)處理，這時(shí)只有一種方法就是殺菌后進(jìn)行移栽。胚挽救的苗因內(nèi)生菌的問(wèn)題導(dǎo)致移栽的苗一般都很弱小，移栽到田間很難做到精細(xì)化管理，而在智能育種工廠中則可以進(jìn)行精細(xì)化的水肥管理，待苗長(zhǎng)茁壯后再移至田間，增加胚挽救苗的成活率；若自然條件不適宜時(shí)也可直接在智能育種工廠里種植至成熟。

圖3 胚挽救苗

2.3 智能育種工廠在多倍體水稻抗性改良中的應(yīng)用

現(xiàn)有多倍體水稻種質(zhì)有限，尤其在抗性、品質(zhì)等方面的優(yōu)異資源匱乏，已嚴(yán)重影響了多倍體水稻育種的進(jìn)一步發(fā)展，所以急需大力創(chuàng)制優(yōu)質(zhì)、抗病的多倍體水稻種質(zhì)資源［15］。2019—2020年利用組培技術(shù)結(jié)合武漢雙綠源創(chuàng)芯科技研究院有限公司的GSR40K水稻高密度全基因組SNP芯片在智能育種工廠里創(chuàng)制并改良了含稻瘟病抗性基因的高結(jié)實(shí)四倍體水稻株系。圖4為含稻瘟病抗性基因的高結(jié)實(shí)率四倍體改良過(guò)程，其中2次苗期取葉片進(jìn)行稻瘟病抗性篩選的過(guò)程均在育種工廠內(nèi)進(jìn)行，篩選后將含有抗性基因的幼苗移至大田進(jìn)行選種；雜交試驗(yàn)也在智能育種工廠中完成。

圖4 含稻瘟病抗性基因的高結(jié)實(shí)率四倍體改良過(guò)程

表2為稻瘟病抗性基因的篩選結(jié)果。從表2中可以看出，SYY1、SYY2、SYY3、SYY4、SYY5、SYY6、SYY7、SYY9、SYY10均含有Pia抗性位點(diǎn)；在Xa21抗性位點(diǎn)上，其核心區(qū)域的基因型和代表品種一致，核心區(qū)域下游35 kb范圍內(nèi)發(fā)生了重組，其抗性有待進(jìn)一步驗(yàn)證；SYY8含有Pia及Pi d 3抗性位點(diǎn)；SYY143-1、SYY143-2含有Pi2、Pi5及Xa21抗性位點(diǎn)；SYY416-1、SYY416-2含有Pi2、Pi 5、Pia及Pi t a抗性位點(diǎn)，在X a21抗性位點(diǎn)上，其核心區(qū)域的基因型和代表品種一致，核心區(qū)域下游60 kb范圍內(nèi)發(fā)生了重組，其抗性有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

表2 利用基因芯片進(jìn)行稻瘟病抗性基因的篩選結(jié)果

3 小結(jié)

自育種工廠建成投入使用至今，進(jìn)行了大量試驗(yàn)，結(jié)果表明，在全生育期智能育種工廠內(nèi)可實(shí)現(xiàn)一年3～4代的從種子到種子水稻加代快繁體系建設(shè)；可以正確地進(jìn)行多倍體水稻加倍苗的倍性形態(tài)學(xué)鑒定；可以一年反復(fù)多次進(jìn)行水稻幼穗和花藥組培試驗(yàn)取材工作；可以在育種工廠內(nèi)實(shí)現(xiàn)雜交育種，并大大增加胚挽救苗成活率；可以輔助完成優(yōu)質(zhì)、高抗的高結(jié)實(shí)四倍體水稻新材料的創(chuàng)制及改良工作等。多倍體水稻全生育期智能育種工廠的建設(shè)可以加快多倍體水稻的育種進(jìn)程。