金一春，許柯，朱駿，曹向英，孫文梅，胡曉艷

（上海市松江區(qū)食用農(nóng)產(chǎn)品安全監(jiān)督檢測中心，上海 松江 201611）

豬藍耳病是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種急性高致病性傳染病，其變異毒株的感染可引起高發(fā)病率和高死亡率，因其傳播速度快、發(fā)病率高，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失，成為危害當前養(yǎng)豬業(yè)的主要疫病之一［1］。目前，豬藍耳病尚無特效治療藥物，我國一直采取疫苗接種的方法來預防和控制［2］。

為了解上海松江區(qū)豬群豬藍耳病的免疫效果，準確掌握其流行病學規(guī)律，筆者于2016～2020年采用ELISA方法和熒光RT-PCR方法對本區(qū)內(nèi)規(guī)模場、種養(yǎng)結(jié)合家庭農(nóng)場的豬群在春秋兩季進行集中監(jiān)測。

1 材料

1.1 被檢樣品 選擇上海市松江區(qū)規(guī)模場、種養(yǎng)結(jié)合家庭農(nóng)場的豬群，于2016～2020 年共采集5 728份豬血液樣品，其中規(guī)模場3 867份、種養(yǎng)結(jié)合家庭農(nóng)場1 861份。

1.2 檢測試劑 豬繁殖與呼吸綜合征酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒、熒光聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測試劑盒，分別購自IDEXX 和北京生科尚儀科技有限公司；磁珠法核酸提取試劑盒購自廣州美基生物科技有限公司。

2 方法

2.1 ELISA檢測

2.1.1 操作步驟 檢測試劑在室溫下充分回溫，用超純水將濃縮洗液作10倍稀釋，用樣品稀釋液將被檢血清作40 倍稀釋，陰、陽性對照血清不作稀釋；在微量反應板各相應孔中加入已處理過的被檢血清及陰、陽性對照血清各100 μL，振蕩混勻，封膜，21 ℃下孵育30 min；用約300 μL 洗滌液重復洗滌板孔4 次，最后一次洗滌后將板拍干；每孔加入酶標抗豬IgG 抗體100 μL，振蕩混勻，封膜，21 ℃下孵育30 min；同樣洗板4 次拍干后，每孔加入TMB 底物溶液100 μL，避光21 ℃孵育15 min；每孔加入終止液100 μL，混勻后置酶標儀上，用單波長650 nm讀取結(jié)果。

2.1.2 結(jié)果分析 在實驗條件成立下，分析S∕P值：若S∕P＜0.4，則該樣品為豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體陰性；若S∕P≥0.4，則該樣品為豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體陽性。

2.2 熒光RT-PCR檢測

2.2.1 核酸提取 準備96 孔板，分別取130 μL Buffer MLB及10μL Proteinase K和10 μL MagBind Particles加入孔A，再取已處理樣品及陰陽性對照各50 μL加入孔A；取150 μL Buffer MW1 加入孔B；取150 μL Buffer MW2 加入孔C、D；取50 μL Nuclease Free Water 加入孔H，將96 孔板與磁力外套放入儀器相應位置，啟動程序運行至結(jié)束；將96孔板孔H中的液體吸入1.5 mL離心管中，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 核酸擴增 反應總體積25.5 μL，分別含15 μL PCR 反應液，0.25 μL TaqDNA 酶，0.25 μL PCR 酶及10 μL 模板。擴增條件：42 ℃30 min，92 ℃3 min；92 ℃10 s，45 ℃30 s，72 ℃60 s，5次循環(huán)；92 ℃10 s，60 ℃30 s，40次循環(huán)。

2.2.3 結(jié)果分析 在實驗條件成立下，分析Ct值：Ct 值小于30 且出現(xiàn)典型的擴增曲線者，判為陽性。

3 結(jié)果

3.1 2016～2020 年間豬藍耳病免疫抗體檢測結(jié)果 從表1 可以看出，2016～2020 年間松江區(qū)規(guī)模場、種養(yǎng)結(jié)合家庭農(nóng)場的豬藍耳病抗體免疫合格率分別為89.8%、86.8%、91.2%、95.3%、91.6%和94.6%、93.3%、99.0%、98.6%、90.9%，均達到群體抗體合格率大于或等于70%的要求。2016～2019 年規(guī)模場的豬藍耳病抗體免疫合格率略低于種養(yǎng)結(jié)合家庭農(nóng)場。2016～2017 年及2019～2020 年松江區(qū)豬藍耳病抗體免疫合格率總體呈下降趨勢，如圖1所示。

表1 2016～2020年上海市松江區(qū)豬藍耳病免疫抗體檢測結(jié)果

圖1 2016～2020年松江區(qū)豬藍耳病免疫抗體合格率趨勢圖

3.2 2016～2020年間豬藍耳病病毒RT-PCR檢測結(jié)果 從表2檢測結(jié)果可以看出，除了2016年規(guī)模場有檢測出豬藍耳病陽性（陽性率為0.7%）外，其他年份均未檢出。

表2 2016～2020年上海市松江區(qū)豬藍耳病病原學檢測結(jié)果

4 討論

4.1 從本次監(jiān)測結(jié)果來看，上海市松江區(qū)豬藍耳病的整體免疫情況良好，但通過此次監(jiān)測發(fā)現(xiàn)在疫病免疫防控工作上仍有上升空間，應加強防控監(jiān)管力度。

4.2 飼養(yǎng)管理、仔豬補欄、免疫接種、診斷治療等不規(guī)范操作都會影響抗體免疫效果。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)2016～2019 年規(guī)模場的豬藍耳病免疫抗體合格率低于種養(yǎng)結(jié)合家庭農(nóng)場，2016～2017年及2019～2020 年豬藍耳病免疫抗體合格率總體呈下降趨勢，分析原因可能與豬場的免疫程序及豬群健康狀況等因素有關。為了確保豬群的免疫效果，應加強主要疫病的持續(xù)監(jiān)測，科學制定符合生產(chǎn)實際的免疫程序。

4.3 針對2016 年檢出豬藍耳病陽性的情況，筆者還應用熒光PCR檢測方法對2016年和2017年的血液樣本進行了豬圓環(huán)病毒2 型檢測，結(jié)果顯示2016、2017 年豬圓環(huán)病毒2 型的陽性率分別是10.2%、0.8%，由此推測2016、2017 年規(guī)模場豬群有豬圓環(huán)病毒2型感染現(xiàn)象，由于其免疫抑制性，嚴重影響了豬藍耳病免疫抗體的產(chǎn)生。豬場應引起重視，建立良好的飼養(yǎng)管理措施，制定科學的消毒程序，嚴格生物安全管理制度，保證飼料品質(zhì)和青綠飼料的供給，減少豬群應激［3］，加強豬群自身免疫力提升，從而提高免疫效果。

4.4 控制豬藍耳病應以預防為主［4］，豬群注射疫苗后應進行定期、持續(xù)的免疫抗體監(jiān)測，及時了解免疫效價水平，對免疫效果不理想的豬群及時補免，最終提高本地區(qū)豬藍耳病的防制效果?！?/p>