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        藏豬流行性腹瀉病毒感染診斷

        2021-10-22 06:13:20徐林張朝輝湯承張斌
        四川畜牧獸醫(yī) 2021年10期
        關(guān)鍵詞:分析檢測

        徐林,張朝輝,湯承,張斌

        (1.四川省甘孜州動物疫病預(yù)防控制中心,四川 康定 626000;2.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,四川 成都 610041)

        豬流行性腹瀉病毒(PEDV)可引發(fā)豬只嚴(yán)重腹瀉。PEDV基因組編碼的刺突Spike(S)蛋白在感染宿主的過程中具有重要作用,分析S 基因可了解PEDV毒株分子特征。藏豬主要生活在青藏高原,腹瀉是嚴(yán)重危害藏豬仔豬的常見疾病。

        1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

        1.1 材料

        1.1.1 病料 某規(guī)模化藏豬場病豬的新鮮糞便樣本。

        1.1.2 主要試劑和儀器 Trizol 試劑盒(RNAiso Plus),DEPC,無水乙醇,異丙醇,QuickTaq HS DyeMix,Marker II,PrimerScriptTMRT 試劑盒,LB培養(yǎng)基,高速離心機(jī)等。

        1.1.3 引物 檢測引物序列如表1。

        表1 檢測引物序列信息表

        1.2 方法

        1.2.1 核酸提取 糞便樣本經(jīng)處理后提取總RNA。利用PrimeScriptTMRT 試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

        1.2.2 RT-PCR檢測腹瀉病原 按照各個(gè)病毒檢測引物相應(yīng)的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng),退火溫度均為51 ℃。反應(yīng)體系為:Quick Taq HS DyeMix 5 μL,上下游引物各0.5 μL,cDNA 模板1 μL,ddH2O 3 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 2 min,94 ℃30 s,51 ℃30 s,72 ℃30 s,循環(huán)36次,72 ℃延伸8 min,16 ℃保存。

        1.2.3 PCR 產(chǎn)物的克隆、轉(zhuǎn)化及測序 對檢測呈陽性的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化。按照PCR 純化試劑盒說明書進(jìn)行操作,以純化目的條帶。按照pMD19-T 載體說明書進(jìn)行操作,進(jìn)行連接。將上述的連接產(chǎn)物按照感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α操作說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)化。陽性克隆菌液外送測序。

        1.2.4 PEDV S基因全基因擴(kuò)增 挑選陽性樣本進(jìn)行完整的S 基因的擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系為:Quick Taq HS DyeMix 12.5 μL,上下游引物各1 μL,cDNA 模板2 μL,ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃2 min,94 ℃30 s,55 ℃30 s,72 ℃30 s,循環(huán)35次,72 ℃延伸8 min,16 ℃保存。

        1.2.5 系列相似性及進(jìn)化樹分析 將測序結(jié)果進(jìn)行拼接比對,使用Megalign 6.0 軟件和MEGA 7軟件等進(jìn)行序列分析。包括序列的同源性分析以及遺傳進(jìn)化分析。

        2 結(jié)果

        2.1 發(fā)病情況、臨床診斷 發(fā)病豬場存欄約200頭藏豬,豬群未進(jìn)行腹瀉病毒疫苗免疫接種。該場仔豬在飼養(yǎng)過程中出現(xiàn)腹瀉等癥狀,并在短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)較大范圍的傳播,部分圈舍豬發(fā)病率達(dá)80%,死亡率約10%。

        發(fā)病仔豬采食量嚴(yán)重下降,精神差,嚴(yán)重者脫水、死亡。豬怕冷扎堆,瘦弱無力,多處黏膜發(fā)紺。個(gè)別病豬體溫上升,排黃綠色水樣惡臭糞便。剖檢發(fā)現(xiàn)患豬主要病理變化出現(xiàn)于消化器官,其胃黏膜變紅,腸黏膜脫落,腸壁充盈甚至透明,腸內(nèi)充滿水樣物。初步診斷為病毒性感染。

        2.2 腹瀉病原RT-PCR 檢測結(jié)果 采集3 份病豬新鮮糞便送實(shí)驗(yàn)室檢測。采用RT-PCR 方法分別檢測TGEV,PEDV,PDCoV 和PoRV,檢測引物序列如表1。檢測結(jié)果顯示TGEV,PoRV 和PDCoV 均呈陰性,3 份樣本PEDV 檢測結(jié)果均呈陽性。PEDV 檢測結(jié)果如圖1。結(jié)果表明PEDV是導(dǎo)致藏豬場豬腹瀉的主要原因。

        圖1 樣本PEDV檢測電泳圖

        2.3 序列分析 為了解PEDV 流行毒株特征,選擇一份樣本進(jìn)行完整的S 基因擴(kuò)增,并進(jìn)行測序。所獲得序列命名為CH∕TP-2-2,S 基因全長為4 146 bp,編碼1 381 個(gè)氨基酸,已將序列上傳至GenBank MK140811。通過與參考毒株進(jìn)行序列比對分析,證實(shí)擴(kuò)增的片段是PEDV。同源性分析顯示,本研究所獲得PEDV 流行毒株的CH∕SCCZ∕2018 和CH∕GZJP∕2017 等毒株同源關(guān)系最近,同源性為98%,而與經(jīng)典毒株CV777 株的同源性有94.9%。

        2.4 遺傳進(jìn)化分析 遺傳進(jìn)化樹顯示,本研究所獲得PEDV 流行毒株與OH851、CH∕SCCZ∕2018 和CH∕GZJP∕2017 等毒株聚在一支。參考文獻(xiàn)對PEDV 毒株的分型,確定本試驗(yàn)所獲得PEDV 流行毒株為G1c 型(圖2),而與CV777 和AJ1102 等經(jīng)典毒株相距較遠(yuǎn),說明PEDV 一直處于遺傳進(jìn)化中。■

        圖2 PEDV S基因的遺傳進(jìn)化樹

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