徐林，張朝輝，湯承，張斌

（1.四川省甘孜州動物疫病預(yù)防控制中心，四川 康定 626000；2.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041）

豬流行性腹瀉病毒（PEDV）可引發(fā)豬只嚴(yán)重腹瀉。PEDV基因組編碼的刺突Spike（S）蛋白在感染宿主的過程中具有重要作用，分析S 基因可了解PEDV毒株分子特征。藏豬主要生活在青藏高原，腹瀉是嚴(yán)重危害藏豬仔豬的常見疾病。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料 某規(guī)模化藏豬場病豬的新鮮糞便樣本。

1.1.2 主要試劑和儀器 Trizol 試劑盒（RNAiso Plus），DEPC，無水乙醇，異丙醇，QuickTaq HS DyeMix，Marker II，PrimerScriptTMRT 試劑盒，LB培養(yǎng)基，高速離心機(jī)等。

1.1.3 引物 檢測引物序列如表1。

表1 檢測引物序列信息表

1.2 方法

1.2.1 核酸提取 糞便樣本經(jīng)處理后提取總RNA。利用PrimeScriptTMRT 試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.2 RT-PCR檢測腹瀉病原 按照各個(gè)病毒檢測引物相應(yīng)的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，退火溫度均為51 ℃。反應(yīng)體系為：Quick Taq HS DyeMix 5 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA 模板1 μL，ddH2O 3 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 2 min，94 ℃30 s，51 ℃30 s，72 ℃30 s，循環(huán)36次，72 ℃延伸8 min，16 ℃保存。

1.2.3 PCR 產(chǎn)物的克隆、轉(zhuǎn)化及測序 對檢測呈陽性的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化。按照PCR 純化試劑盒說明書進(jìn)行操作，以純化目的條帶。按照pMD19-T 載體說明書進(jìn)行操作，進(jìn)行連接。將上述的連接產(chǎn)物按照感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α操作說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)化。陽性克隆菌液外送測序。

1.2.4 PEDV S基因全基因擴(kuò)增 挑選陽性樣本進(jìn)行完整的S 基因的擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系為：Quick Taq HS DyeMix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃2 min，94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，循環(huán)35次，72 ℃延伸8 min，16 ℃保存。

1.2.5 系列相似性及進(jìn)化樹分析 將測序結(jié)果進(jìn)行拼接比對，使用Megalign 6.0 軟件和MEGA 7軟件等進(jìn)行序列分析。包括序列的同源性分析以及遺傳進(jìn)化分析。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)病情況、臨床診斷 發(fā)病豬場存欄約200頭藏豬，豬群未進(jìn)行腹瀉病毒疫苗免疫接種。該場仔豬在飼養(yǎng)過程中出現(xiàn)腹瀉等癥狀，并在短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)較大范圍的傳播，部分圈舍豬發(fā)病率達(dá)80%，死亡率約10%。

發(fā)病仔豬采食量嚴(yán)重下降，精神差，嚴(yán)重者脫水、死亡。豬怕冷扎堆，瘦弱無力，多處黏膜發(fā)紺。個(gè)別病豬體溫上升，排黃綠色水樣惡臭糞便。剖檢發(fā)現(xiàn)患豬主要病理變化出現(xiàn)于消化器官，其胃黏膜變紅，腸黏膜脫落，腸壁充盈甚至透明，腸內(nèi)充滿水樣物。初步診斷為病毒性感染。

2.2 腹瀉病原RT-PCR 檢測結(jié)果 采集3 份病豬新鮮糞便送實(shí)驗(yàn)室檢測。采用RT-PCR 方法分別檢測TGEV，PEDV，PDCoV 和PoRV，檢測引物序列如表1。檢測結(jié)果顯示TGEV，PoRV 和PDCoV 均呈陰性，3 份樣本PEDV 檢測結(jié)果均呈陽性。PEDV 檢測結(jié)果如圖1。結(jié)果表明PEDV是導(dǎo)致藏豬場豬腹瀉的主要原因。

圖1 樣本PEDV檢測電泳圖

2.3 序列分析 為了解PEDV 流行毒株特征，選擇一份樣本進(jìn)行完整的S 基因擴(kuò)增，并進(jìn)行測序。所獲得序列命名為CH∕TP-2-2，S 基因全長為4 146 bp，編碼1 381 個(gè)氨基酸，已將序列上傳至GenBank MK140811。通過與參考毒株進(jìn)行序列比對分析，證實(shí)擴(kuò)增的片段是PEDV。同源性分析顯示，本研究所獲得PEDV 流行毒株的CH∕SCCZ∕2018 和CH∕GZJP∕2017 等毒株同源關(guān)系最近，同源性為98%，而與經(jīng)典毒株CV777 株的同源性有94.9%。

2.4 遺傳進(jìn)化分析 遺傳進(jìn)化樹顯示，本研究所獲得PEDV 流行毒株與OH851、CH∕SCCZ∕2018 和CH∕GZJP∕2017 等毒株聚在一支。參考文獻(xiàn)對PEDV 毒株的分型，確定本試驗(yàn)所獲得PEDV 流行毒株為G1c 型（圖2），而與CV777 和AJ1102 等經(jīng)典毒株相距較遠(yuǎn)，說明PEDV 一直處于遺傳進(jìn)化中。■

圖2 PEDV S基因的遺傳進(jìn)化樹