肖長栓,劉婭平,楊景哲

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 1.燒傷整形科，2.婦二科，河北省承德市 067000)

吸入性損傷發(fā)病隱匿、癥狀多不典型，是一種呼吸道和肺實質(zhì)共同損傷的燒傷危急重癥。吸入性損傷后，肺部可發(fā)生嚴(yán)重失控性炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生大量氧自由基，多表現(xiàn)為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)及多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODF)[1]。因此，為其尋找早期適當(dāng)干預(yù)手段一直是國內(nèi)外研究的熱點問題。依達(dá)拉奉(edaravone，EDA)通過抑制脂質(zhì)過氧化及抗氧化從而發(fā)揮神經(jīng)系統(tǒng)保護作用、減輕多種原因所致的肺組織損傷[2-5]。EDA容易穿過細(xì)胞膜且霧化吸入可直接作用于靶器官[6]。本實驗通過霧化吸入EDA干預(yù)煙霧吸入性肺損傷大鼠模型，研究其對該模型大鼠肺的保護作用。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

依達(dá)拉奉(edaravone，EDA)購自雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司(原料藥，國藥準(zhǔn)字H20130053，純度：99.7%)。大鼠腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)、半胱氨酸蛋白酶-3(cysteine protease 3，Caspase-3)酶聯(lián)免疫吸附分析法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購自美國R&D公司；大鼠肺髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、考馬斯亮藍(lán)蛋白檢測試劑盒購自南京建成公司；原位末端標(biāo)記(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)檢測陽性對照制備試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；微量加樣器購自德國Eppendorf公司；ELX800UV型酶標(biāo)檢測儀購自美國Bio Tek公司；CK40型光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus公司；Centrifuge5702離心機購自德國Eppendorf公司；RM2235型石蠟切片機購自德國Leica公司；ABL-800型血氣分析儀購自丹麥Radiometer公司；PARI Turbo BOY N系列霧化機購自德國PARI GmbH公司；KD-BM生物組織包埋機購自浙江科迪儀器設(shè)備公司。

1.2 實驗動物及分組

清潔級雄性SD大鼠30只，60～70日齡，體質(zhì)量約(200±20)g，由中國食品藥品檢定研究院提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2017-0005。飼養(yǎng)溫度22～25 ℃，自由飲食、飲水。并于實驗前12 h禁食、自由飲水。將其隨機分為對照組、模型組、EDA低劑量組、EDA高劑量組、EDA預(yù)防組，每組6只。本實驗獲承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，動物處置方法符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 動物造模及干預(yù)方法

參考文獻(xiàn)[7]，各組腹腔注射鹽酸氯胺酮(0.1 mg/g)后行氣管切開術(shù)：頸胸部剃毛消毒后鋪無菌巾，行頸胸部正中切口，氣管切開，置入氣管導(dǎo)管。氣管導(dǎo)管連接呼吸機螺紋管后以4601型小動物呼吸機行機械通氣，呼吸頻率為80次/min，潮氣量為10 μL/g，吸呼比為1∶2，吸入30%的氧。螺紋管末端連接三通管后與壓力轉(zhuǎn)換接頭相連，動態(tài)監(jiān)測氣道壓(airway pressure,Paw)。Paw穩(wěn)定20 min后，參照文獻(xiàn)[5,8]，除對照組外其他組大鼠制作煙霧吸入性損傷模型：煙霧發(fā)生器打開致傷室進(jìn)氣口閥門和風(fēng)扇，內(nèi)置入適量松木屑后發(fā)煙15 min，當(dāng)煙霧報警器報警后打開排氣口閥門、風(fēng)扇，排氣口用聚乙烯導(dǎo)管連接三通管一端，使各組大鼠均勻吸入煙霧5 min后關(guān)閉排氣口閥門5 min，按上述步驟操作3次。

參照文獻(xiàn)[9]設(shè)定各組大鼠藥物干預(yù)時間和劑量：對照組不吸入任何藥物；模型組、EDA低劑量及高劑量組分別在致傷后30 min霧化吸入生理鹽水、1.8 g/L、3.6 g/L EDA，0.1 mL/min，10 min，間隔1 h重復(fù)1次，共4次；EDA預(yù)防組致傷前10 min(預(yù)處理)霧化吸入1.8 g/L EDA 0.1 mL/min，10 min，致傷后30 min霧化吸入1.8 mg/mL EDA 10 min，間隔1 h重復(fù)1次，共3次。

1.4 氧合指數(shù)、肺組織含水率及濕干比測定

致傷后6 h，留取各組大鼠頸動脈血1 mL 30 min內(nèi)行血氣分析，計算氧合指數(shù)(oxygenation index，OI)；剖腹留取腹主動脈血5 mL后處死動物，迅速取出肺組織，選擇右肺組織前葉及中葉標(biāo)本，稱濕重并記錄，隨后放入恒溫電烤箱中80 ℃烘烤48 h，稱干重并記錄。含水率(%)=(濕重-干重)/濕重×100%，濕重與干重之間比值為濕干比(wet to dry ratio，W/D)。

1.5 血清TNF-α、IL-6、IL-10測定

采用雙抗體夾心ELISA法。將腹主動脈血標(biāo)本離心15 min后取上清液，-20 ℃冷凍保存。解凍血清標(biāo)本，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，酶標(biāo)儀450 nm波長處讀取光密度(optical density，OD)值，計算樣品中TNF-α、IL-6、IL-10含量。

1.6 肺組織MDA、MPO、SOD測定

將取出的左肺組織保存于-70 ℃冰箱中。解凍左肺組織標(biāo)本，濾紙吸干，電動研磨器充分研磨，制備組織勻漿?？捡R斯亮藍(lán)蛋白測定法測定勻漿液中蛋白水平后嚴(yán)格按照試劑盒說明書，分別在460、532、550 nm波長處測定各管MDA、MPO、SOD的OD值，計算組織中MDA、MPO、SOD含量。

1.7 肺組織Caspase-3、細(xì)胞凋亡率測定

取肺組織勻漿液適量，按照試劑盒說明書操作，酶標(biāo)儀在450 nm波長處讀取各管OD值，計算組織中Caspase-3含量。采用TUNEL方法分析肺組織細(xì)胞凋亡情況。將取出的右肺后葉經(jīng)4%的甲醛固定24 h，取適量固定好的右肺后葉組織脫水、包埋、切片、TUNEL染色。每只大鼠隨機選取5個非重疊高倍鏡視野(400×)，計數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，細(xì)胞凋亡率(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.8 肺組織蘇木精-伊紅染色切片

取適量4%甲醛固定好的右肺后葉，依次進(jìn)行脫水、包埋、切片、蘇木精-伊紅(hematoxylin eosin，HE)染色后光鏡下觀察。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組OI、肺組織含水率及W/D的比較

與對照組比較，其余各組OI均明顯降低，肺組織含水率、W/D均顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，EDA低劑量、高劑量及預(yù)防組OI明顯升高(P<0.05)，呈遞增趨勢；肺含水率、W/D顯著降低，呈遞減趨勢(P<0.05；表1)。

表1 各組OI、肺組織含水率及W/D的比較(n=6)

2.2 各組血清TNF-α、IL-6及IL-10水平的比較

與對照組比較，其余各組TNF-α、IL-6及IL-10水平均明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，EDA低劑量、高劑量及預(yù)防組TNF-α、IL-6水平均顯著降低，呈遞減趨勢；IL-10水平均明顯升高，呈遞增趨勢(P<0.05；表2)。

表2 各組血清TNF-α、IL-6、IL-10水平的比較(n=6) 單位：ng/L

2.3 各組肺組織MDA、MPO及SOD水平的比較

與對照組比較，其余各組MDA、MPO水平均明顯升高，SOD水平均顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，EDA低劑量、高劑量及預(yù)防組MDA、MPO水平顯著降低，呈遞減趨勢；SOD水平明顯升高，呈遞增趨勢(P<0.05；表3)。

表3 各組肺組織MDA、MPO、SOD水平的比較(n=6)

2.4 各組肺組織Caspase-3含量及細(xì)胞凋亡率比較

與對照組比較，其余各組Caspase-3含量及細(xì)胞凋亡率均明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，EDA低劑量、高劑量及預(yù)防組Caspase-3含量及細(xì)胞凋亡率均顯著降低，呈遞減趨勢(P<0.05；表4)。

表4 各組肺組織Caspase-3含量及細(xì)胞凋亡率的比較(n=6)

2.5 肺組織病理切片檢查

對照組肺泡腔內(nèi)無炎性細(xì)胞浸潤，且結(jié)構(gòu)清晰、完整，壁光滑且均勻；模型組肺泡腔內(nèi)有大量炎癥細(xì)胞浸潤及紅細(xì)胞漏出，肺泡結(jié)構(gòu)混亂，呈不同程度的擴張或萎縮，肺泡壁增厚明顯且厚度不勻；EDA低劑量組肺泡腔內(nèi)仍有一定數(shù)量的炎癥細(xì)胞浸潤及紅細(xì)胞漏出，肺泡結(jié)構(gòu)不清晰，仍有一定程度的擴張或萎縮；EDA高劑量組炎癥細(xì)胞浸潤及紅細(xì)胞漏出程度較EDA低劑量組減輕，肺泡結(jié)構(gòu)較清楚，大小及形態(tài)較一致；EDA預(yù)防組肺泡腔內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤及紅細(xì)胞漏出程度最輕，肺泡結(jié)構(gòu)、大小及形態(tài)較EDA高劑量組進(jìn)一步改善(圖1)。

圖1 各組大鼠肺組織病理切片(HE，400×)

3 討 論

吸入性損傷后，機體釋放大量炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子及氧自由基，啟動凋亡信號通路，造成肺及其他多臟器的繼發(fā)性損害[5,10]。肺損傷后形成肺水腫的原因可能是局部微循環(huán)障礙，微血管阻力升高，肺順應(yīng)性及氧合能力降低[11]。本實驗通過檢測氧合指數(shù)、肺組織含水率及W/D反映肺水腫及微血管損傷的程度。依達(dá)拉奉可通過降低炎癥細(xì)胞因子水平及抑制細(xì)胞凋亡通路改善腦損傷所致的神經(jīng)功能癥狀[12-13]。結(jié)果顯示各組致傷大鼠肺泡腔內(nèi)外可見炎癥細(xì)胞浸潤，提示煙霧吸入性肺損傷模型制作成功；模型組較對照組肺組織含水率及W/D顯著升高、OI降低，EDA各組又較模型組肺含水率及W/D降低、OI升高，炎癥細(xì)胞浸潤減輕，且上述變化EDA預(yù)防組最明顯，說明霧化吸入依達(dá)拉奉能減輕炎癥細(xì)胞浸潤及肺組織氧合情況，并具有劑量依賴性，且早期應(yīng)用效果較好，但具體作用原理需深入研究。

近年來，對于合并吸入性損傷的患者仍缺乏有效的干預(yù)方法[11]。以往研究表明，對于肺損傷預(yù)防性應(yīng)用依達(dá)拉奉，研究對象未出現(xiàn)任何藥物不良反應(yīng)，研究結(jié)論具有一定臨床指導(dǎo)意義并得到普遍認(rèn)可[14]；吸入性損傷漏診率較高，早期干預(yù)還可把握最佳的治療時機，降低后期的治療難度及死亡率。

吸入性損傷可促進(jìn)多種炎癥細(xì)胞產(chǎn)生及釋放TNF-α，可增加骨髓白細(xì)胞釋放、激活外周血管內(nèi)皮細(xì)胞及促進(jìn)血液中多形核白細(xì)胞趨化吞噬能力，提高IL-1、IL-6等細(xì)胞因子的水平[15]。高水平的IL-6可啟動并延續(xù)局部及全身級聯(lián)瀑布式炎癥反應(yīng)。TNF-α、IL-6是反映組織損傷程度的重要標(biāo)志，可提示多臟器功能障礙，因此可作為觀察肺損傷治療效果的可靠指標(biāo)[16]。IL-10可通過下調(diào)主要組織相容性復(fù)合物、抑制單核巨噬細(xì)胞合成分泌TNF-α、IL-6及IL-1β，對組織細(xì)胞起到顯著的保護作用[17-18]。本實驗通過測定IL-10的水平來間接反映機體抗炎能力。本文中EDA各組較模型組血清IL-6、TNF-α水平均降低，IL-10水平均升高，且此變化以EDA預(yù)防組最突出，說明對于煙霧吸入性損傷，霧化吸入依達(dá)拉奉具有良好的抗炎作用，并呈劑量依賴性，且預(yù)防用藥效果更好。

SOD可通過抑制化學(xué)趨向性因子，切斷炎癥反應(yīng)通路發(fā)揮抗氧化作用，是反映清除氧自由基能力的重要指標(biāo)[12]。炎癥細(xì)胞相互作用可使肺部MPO活性升高，反映了組織細(xì)胞中炎癥細(xì)胞的浸潤程度。MDA為脂質(zhì)過氧化中產(chǎn)物，反映組織細(xì)胞受自由基的攻擊程度[19]。模型組MDA及MPO水平較對照組升高，SOD降低，機體氧化/抗氧化平衡被破壞，EDA各組較模型組呈反向變化，且此變化EDA預(yù)防組最明顯，表明高劑量霧化吸入依達(dá)拉奉對煙霧吸入性損傷具有更為顯著的抗氧化作用，且預(yù)防性用藥效果更好。

吸入性損傷發(fā)生后，細(xì)胞內(nèi)線粒體膜通透性增加，細(xì)胞色素C等凋亡啟動因子逸出，使凋亡執(zhí)行因子Caspase-3活性增加，導(dǎo)致廣泛的組織細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)并加重肺損傷[20]。Caspase-3的活化是細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆階段的重要標(biāo)志，本實驗通過測定肺組織中Caspase-3含量及細(xì)胞凋亡率，來反映吸入性損傷過程中肺組織的凋亡情況。模型組肺組織Caspase-3及細(xì)胞凋亡率水平均較對照組升高，而EDA各組上述指標(biāo)水平較模型組則明顯降低，且EDA預(yù)防組降低程度最明顯，說明霧化吸入依達(dá)拉奉可能通過Caspase-3信號通路使吸入性損傷后肺組織細(xì)胞凋亡程度減輕，并表現(xiàn)為劑量依賴性，預(yù)防用藥的效果更好。

綜上，霧化吸入依達(dá)拉奉可能通過減少炎癥介質(zhì)/細(xì)胞因子的產(chǎn)生及釋放、降低過氧化損傷及抑制細(xì)胞凋亡對煙霧吸入性肺損傷起到保護作用，在一定范圍內(nèi)呈明顯的劑量依賴性，且適當(dāng)時機的預(yù)防性用藥效果更佳。