陳紫昕, 劉海燦, 屈勇剛, 鄧云麗, 宋德強(qiáng), 徐春生, 祁鳳華, 萬(wàn)康林, 劉志廣, 袁秀琴

(1.南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南省衡陽(yáng)市421001；2.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京市102206；3.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆維吾爾自治區(qū)石河子市832003；4.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第八師石河子市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，新疆維吾爾自治區(qū)石河子市832000)

人獸共患病是發(fā)生于人和動(dòng)物間的傳染性疾病，病毒、細(xì)菌或寄生蟲(chóng)可作為其病原體，通過(guò)直接或間接接觸傳播給人類[1-3]。宏基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)樣本中的核酸直接進(jìn)行測(cè)序，與微生物數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，根據(jù)比對(duì)得到的序列信息判斷樣本包含的病原微生物種類，能夠快速檢測(cè)出樣本中較多的病原微生物，且無(wú)需特異性擴(kuò)增[4]。由于關(guān)于中國(guó)羊體內(nèi)細(xì)菌菌群及攜帶的人獸共患病原菌的研究較少，因此本文采用宏基因組測(cè)序方法了解新疆羊呼吸道及消化道中主要的細(xì)菌種類和分布情況，以及其攜帶的人獸共患主要病原菌，為羊健康養(yǎng)殖和相關(guān)疾病預(yù)防控制提供一定的基礎(chǔ)科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品來(lái)源

樣品來(lái)自新疆南疆(喀什市)和北疆(石河子市)的大型牧區(qū)，于2019年8月同期進(jìn)行樣品采集。其中，石河子市采得羊肛拭子140份，羊口咽拭子43份；喀什市采得羊肛拭子91份，羊口咽拭子29份，共303份樣品。為避免交叉污染，均使用一次性棉拭子采集樣品，并密封在無(wú)菌容器中，利用車載冰箱運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，保存于-70 ℃超低溫冰箱。

1.2 DNA提取及測(cè)序

收集的樣品由武漢華大基因公司進(jìn)行DNA提取及檢測(cè)。按照DNA提取試劑盒(CTAB方法)提取樣品全基因組DNA。檢測(cè)DNA的完整性采用1%瓊脂糖凝膠電泳法。通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)量DNA水平。按照同地區(qū)采集的DNA樣品混合，羊口咽樣品每6份一組，獲得12組構(gòu)建文庫(kù)；羊肛樣品每7份一組，得33組構(gòu)建文庫(kù)。文庫(kù)構(gòu)建及上機(jī)測(cè)序同由武漢華大基因科技服務(wù)有限公司完成。

1.3 序列處理及統(tǒng)計(jì)分析

BGISEQ測(cè)序所得原始序列數(shù)據(jù)用FLASH軟件進(jìn)行拼接，經(jīng)Trimmomatic軟件將拼接得到的序列進(jìn)行質(zhì)控過(guò)濾，使用Kraken2軟件以及配套的Minikrakenv2數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種分類。應(yīng)用R軟件進(jìn)行主坐標(biāo)分析(principal coordinate analysis,PCoA)和相似性分析(analysis of similarity,ANOSIM)，使用Python(V3.6包)Statsmodels(V0.10.1)進(jìn)行Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析潛在人獸共患病原菌的差異性。

2 結(jié) 果

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)

本研究最終獲得12組羊口咽拭子和33組羊肛拭子樣品的宏基因組數(shù)據(jù)，3 045 503 100條序列，每組樣品平均讀長(zhǎng)均為150 bp。根據(jù)宏基因組序列數(shù)據(jù)分析，共得到4界27門(mén)47綱103目195科410屬544種。45份羊樣品中豐度占比最大的為細(xì)菌。選擇3個(gè)層級(jí)即門(mén)、屬和種的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較和展示。

2.2 不同羊樣品細(xì)菌種類的比較

2.2.1 細(xì)菌種類的比較 在門(mén)水平上，羊口咽樣品中檢出前5位的細(xì)菌為變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、放線菌門(mén)和軟壁菌門(mén)；而羊肛樣品中為變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、放線菌門(mén)和疣微菌門(mén)。變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)在兩種樣品的細(xì)菌豐度均為最高(圖1)。在屬水平上，羊口咽樣品中檢出前5位的細(xì)菌為莫拉氏菌屬、曼氏桿菌屬、比伯斯坦菌屬、巴氏桿菌屬和不動(dòng)桿菌屬；而羊肛樣品中為擬桿菌屬、彎曲桿菌屬、埃希氏菌屬、叢毛單胞菌屬和雙歧桿菌屬。在屬水平上，羊口咽樣品的細(xì)菌物種與羊肛樣品的不大相同(圖1)。

圖1 在門(mén)水平和屬水平上不同羊樣品細(xì)菌組成圖

2.2.2 人獸共患病細(xì)菌種類的比較 在種水平上，羊口咽樣品與羊肛樣品含有潛在的人獸共患病細(xì)菌為大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌、大腸彎曲桿菌、蠟樣芽孢桿菌、豬鏈球菌、空腸彎曲桿菌、沙門(mén)氏菌和鮑曼不動(dòng)桿菌。使用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行差異分析，在不同樣品間比較大腸桿菌和多殺性巴氏桿菌相對(duì)豐度差異有顯著性(P<0.01)，其他細(xì)菌差異均無(wú)顯著性(P>0.05；圖2)。

圖2 不同羊樣品人獸共患病原菌種類的比較a為P<0.01，與羊口咽樣品比較。

2.3 不同地區(qū)羊樣品細(xì)菌種類的比較

2.3.1 細(xì)菌種類的比較 在種水平上，喀什市羊口咽樣品細(xì)菌種類前3為牛莫拉氏菌、溶血性曼氏桿菌和棲瘤胃普雷沃氏菌，羊肛樣品前3為普通擬桿菌、大腸桿菌和糞擬桿菌；石河子市羊口咽樣品細(xì)菌種類前3為溶血性曼氏桿菌、山羊海藻比伯斯坦菌和牛眼莫拉氏菌，羊肛樣品前3為糞擬桿菌、叢毛單胞菌和普通擬桿菌。兩市羊口咽樣品共有的細(xì)菌種類為溶血性曼氏桿菌，羊肛樣品共有的細(xì)菌種類為普通擬桿菌和糞擬桿菌(圖3)。

圖3 在種水平上不同地區(qū)羊拭子樣品中細(xì)菌種類的比較

2.3.2 細(xì)菌種類多樣性分析 對(duì)不同地區(qū)羊口咽及羊肛樣品細(xì)菌種類進(jìn)行基于Euclidean距離的PCoA分析，在屬水平上，喀什市和石河子市羊口咽樣品和羊肛樣品的細(xì)菌種類都較為相似(圖4A和B)。ANOSIM分析顯示，在門(mén)水平上，喀什市和石河子市羊口咽樣品間細(xì)菌群落差異有顯著性(圖4C)；在種水平上，喀什市和石河子市羊肛樣品間細(xì)菌群落差異有顯著性(圖4D)。

圖4 不同地區(qū)羊樣品中細(xì)菌多樣性分析和差異性分析A和B為屬水平；C為門(mén)水平；D為種水平；E和F為差異性分析。a為P<0.05，b為P<0.01，與喀什市比較。

在屬水平上使用Wilcoxon秩檢驗(yàn)對(duì)不同地區(qū)羊口咽和羊肛樣品細(xì)菌種類進(jìn)行差異分析，擬桿菌屬和棒狀桿菌屬在喀什市和石河子市間比較差異有顯著性(P<0.05；圖4E)；小桿菌屬、歐陸森氏菌屬、尿桿菌屬、丙酸桿菌屬和雙歧桿菌屬在喀什市和石河子市間比較差異有顯著性(P<0.05，P<0.01；圖4F)。

2.3.3 人獸共患病細(xì)菌種類的比較 在種水平上，不同地區(qū)羊口咽和羊肛樣品中存在的潛在人獸共患病細(xì)菌為多殺性巴氏桿菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、蠟樣芽孢桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、豬鏈球菌、大腸彎曲桿菌、空腸彎曲桿菌、化膿性鏈球菌和沙門(mén)氏菌。使用Wilcoxon秩檢驗(yàn)進(jìn)行差異分析發(fā)現(xiàn)，在喀什市和石河子市間比較，羊口咽樣品6種潛人獸共患病細(xì)菌均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而羊肛樣品7種潛在人獸共患病細(xì)菌中，大腸彎曲桿菌和空腸彎曲桿菌差異有顯著性(P<0.01)，其他則差異均無(wú)顯著性(P>0.05；圖5)。

圖5 不同地區(qū)羊樣品人獸共患病原菌種類的比較a為P<0.01，與喀什市比較。

3 討 論

當(dāng)前大部分國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)都是基于16SrRNA測(cè)序方法對(duì)羊瘤胃、腸道菌群微生物開(kāi)展研究[5-7]，很少有關(guān)于中國(guó)新疆地區(qū)羊體內(nèi)的細(xì)菌菌群及攜帶的人獸共患病原菌的分析研究。本研究基于華大基因BGISEQ測(cè)序，通過(guò)宏基因組測(cè)序技術(shù)成功地檢測(cè)了新疆羊口咽拭子及肛拭子細(xì)菌菌群的多樣性，獲得大量、全面的菌群信息。

反芻動(dòng)物胃腸道的微生物組成具有較強(qiáng)的相似性是在門(mén)水平上，但在個(gè)體間的區(qū)別往往體現(xiàn)為物種的豐富度和多樣性[8]。在本研究羊樣品中，從不同羊樣品的研究方向來(lái)比較，在門(mén)水平上，其呼吸道和消化道的占主導(dǎo)的細(xì)菌菌群為變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)，這與文獻(xiàn)[6,9-10]研究的結(jié)果一致。有研究發(fā)現(xiàn)，擬桿菌門(mén)在綿羊腸道是優(yōu)勢(shì)物種[11]；還有研究表明，厚壁菌門(mén)、放線菌門(mén)是反芻動(dòng)物腸道中豐度最高、最具代表性的門(mén)水平物種[12]；但也從候萌等[13]研究結(jié)果知研究的阿勒泰羊空腸內(nèi)的優(yōu)勢(shì)物種里沒(méi)有擬桿菌門(mén)，原因可能有：羊的品種、地理環(huán)境或者是飼喂草料的不同等。但是單從兩組樣品的各自的門(mén)分類上看，羊口咽樣品和羊肛樣品檢出前4位的微生物都相同，不同之處在于各自排名第5位的微生物：軟壁菌門(mén)(羊口咽)和疣微菌門(mén)(羊肛)。從Minozzi等[5]對(duì)綿羊后腸微生物菌群的研究可知，疣微菌門(mén)也是綿羊消化道核心菌群之一。在屬分類水平上，兩樣品的優(yōu)勢(shì)菌屬均不相同。有研究表明，擬桿菌屬在蒙古羊腸道微生物里豐度較高的優(yōu)勢(shì)物種[14]；有研究報(bào)告報(bào)導(dǎo)在2907個(gè)山羊樣品和2382個(gè)綿羊樣品中彎曲桿菌的檢出率分別為17.8%和12.6%[15]；Riggio等[16]也在羊的口腔黏膜采集的樣本檢測(cè)出莫拉氏菌。還有研究發(fā)現(xiàn)，莫拉氏菌屬在索馬里綿羊鼻拭子樣本中是優(yōu)勢(shì)物種[17]。

從新疆南疆喀什市和北疆石河子市兩個(gè)地區(qū)采集的羊樣品來(lái)比較分析，結(jié)果表明，在種水平上的羊口咽樣品，石河子市以溶血性曼氏桿菌、山羊海藻比伯斯坦桿菌、牛眼莫拉氏菌為優(yōu)勢(shì)菌；而喀什市采的羊口咽樣品以牛莫拉氏桿菌、棲瘤胃普雷沃氏菌、溶血性曼氏桿菌為優(yōu)勢(shì)菌。兩地的羊口咽樣品共有的細(xì)菌為溶血性曼氏桿菌，江金歡等[18]也從西藏綿羊上呼吸道分離出溶血性曼氏桿菌。在種水平上的羊肛樣品，兩地區(qū)占主導(dǎo)的細(xì)菌菌群種類同為普通擬桿菌、糞擬桿菌和大腸桿菌。

主坐標(biāo)(PCoA)分析，即經(jīng)典多維標(biāo)度(Classical multidimensional scaling)，是一種與PCA類似的用于研究數(shù)據(jù)間的相似性或者差異性的不具約束性的數(shù)據(jù)降維排序分析方法[19]。PCoA展示各個(gè)樣品間的差異大小，較近的樣本表明有很多相似的物種組成。ANOSIM分析，即相似性分析，用來(lái)檢驗(yàn)組間(兩組或多組)差異是否顯著大于組內(nèi)差異，從而判斷分組是否有意義。從不同地區(qū)的羊樣本分析，在種水平上的PCoA分析得出兩地區(qū)的相同樣品間的細(xì)菌種類均相似。ANOSIM分析結(jié)果均得出兩地區(qū)相同的羊樣品間的比較有顯著差異。

在此次的研究中，不僅檢出大量常規(guī)細(xì)菌，還檢出人獸共患病原菌，且大部分屬于細(xì)菌性食源性病原菌。此次樣品發(fā)現(xiàn)的潛在的人獸共患病細(xì)菌有10種：大腸彎曲桿菌、空腸彎曲桿菌、大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、沙門(mén)氏菌、銅綠假單胞菌、蠟樣芽孢桿菌、化膿性鏈球菌和豬鏈球菌[20]。鐘世勛等[21]對(duì)山羊鮑曼不動(dòng)桿菌的病原性研究證實(shí)鮑曼不動(dòng)桿菌為人獸共患病原菌。兩種羊樣品中的大腸桿菌和多殺性巴氏桿菌兩組間的比較有極顯著差異(P<0.01)；從不同地區(qū)采集的樣品方向來(lái)比較，兩地的羊口咽樣品間潛在人獸共患病細(xì)菌的比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而兩地的羊肛樣品間有大腸彎曲桿菌和空腸彎曲桿菌2組潛在人獸共患病細(xì)菌的比較有極顯著差異(P<0.01)。人獸共患病原菌的存在，可對(duì)羊和牧民的健康造成不良影響，還有可能通過(guò)羊源性食品這一媒介導(dǎo)致食源性疾病或人獸共患病的發(fā)生，影響社會(huì)的公共衛(wèi)生安全。

綜上，利用宏基因組學(xué)技術(shù)，對(duì)新疆地區(qū)羊的病原菌群組成及其呼吸和消化系統(tǒng)中的微生物多樣性特征進(jìn)行細(xì)菌門(mén)、屬和種的劃分，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多樣性分析，還分別比較了不同樣品與不同地區(qū)羊細(xì)菌菌群的差異性；了解了新疆羊口咽部和肛門(mén)的菌群的優(yōu)勢(shì)菌屬和差異菌屬；檢出了以食源性傳播為主的人獸共患病原菌，表明存在一定的食品安全和疾病傳播風(fēng)險(xiǎn)。本研究為羊健康養(yǎng)殖和相關(guān)疾病預(yù)防控制提供了一定的科學(xué)數(shù)據(jù)。