鄧慧芝 李銘嬋 陳澤珍 李少靜 廖婉琴 范麗霞（通訊作者）

（佛山科學技術(shù)學院醫(yī)學院，廣東 佛山 528000）

膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤，具有高復發(fā)性、高致殘性、高病死率的特點，嚴重危害人類健康。目前，腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病機制尚未完全闡明，但遺傳易感、環(huán)境污染與其發(fā)病關(guān)系密切[1]。目前對膠質(zhì)瘤的治療仍以手術(shù)為主，但由于腫瘤沒有明顯的邊界，難以做到全部切除。膠質(zhì)瘤臨床治療預后差，手術(shù)療效有限，因而尋找新的治療方法尤為重要。在天然藥物中尋找具有調(diào)控細胞增殖、凋亡的化合物，是目前國內(nèi)外抗腫瘤藥物研發(fā)的熱點。

山竹(Garcinia mangostana.L.)，為藤黃科藤黃屬植物，為熱帶果品中的珍品，有“水果王后”的美譽，營養(yǎng)豐富,具有降燥清熱解毒的功效[2]。原產(chǎn)東南亞,我國廣東、廣西、海南、臺灣等省地多產(chǎn)。山竹適宜種植在低海拔熱帶地區(qū)，結(jié)果期通常需要七、八年。相較于其他水果，山竹含有豐富的蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素及脂類等，外果皮中含有豐富的果膠、植物多酚類物質(zhì)，可入藥，具有抗氧化活性、抗菌和抗癌[3]等功效。山竹果皮中含有多種化合物，其藥理作用成為了近年來的研究熱點。有研究表明山竹果皮提取物對肝癌細胞HepG2 細胞[4]、人鼻咽癌CNE2細胞[5]、直腸癌細胞SW480[6]等有抑制增殖與促進凋亡的作用。

近年來有關(guān)山竹果皮提取物對膠質(zhì)瘤U251 細胞的研究較少，未見有山竹果皮提取物對U251 細胞體外抗腫瘤活性的研究。本實驗對山竹果皮總萃取物的抗腫瘤活性進行了研究，觀察山竹果皮提取物對膠質(zhì)瘤細胞U251 增殖能力的影響。

一、材料與方法

（一）材料與儀器

人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U251（武漢普諾賽生命科技有限公司）；DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司）；胎牛血清(FBS，BI公司)；細胞計數(shù)試劑盒CCK-8（同仁化學研究所）；雙抗P/S（Gibco 公司）；胰酶（Gibco公司）。

Thermo3111/8038二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific公司）；IC 1000細胞計數(shù)儀（上海睿鈺生物科技有限公司）；MK3&4MK2酶標儀（Bio Tek公司）；萬分之一分析天平（JJ224BC，常熟市雙杰測試儀器廠）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-4，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)）；酶標儀（美國Bio Tek 公司）。

（二）方法

1.細胞培養(yǎng)。

人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U251 細胞系培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞呈貼壁生長，培養(yǎng)2～3 d后，用胰酶消化，用細胞計數(shù)儀顯示每毫升的細胞個數(shù)及細胞活性，待細胞數(shù)達到大于（5.0～7.0）×106個/mL、活性高于90%時，取細胞用于實驗。

2.溶液配制。

以10%FBS 的培養(yǎng)基為空白對照組，用培養(yǎng)基對將山竹總提取物進行稀釋，得到6個濃度為0μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L、16μmol/L、32μmol/L的溶液。

3.CCK-8 試劑檢測細胞增殖狀況。

將人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞（U251）接種于96 孔板，每孔接種4000 個細胞，在37℃、5%CO2 的培養(yǎng)箱中孵育。當孔板中細胞完全貼壁且處于對數(shù)生長期時，以含10%FBS的培養(yǎng)基為空白對照組，以DMSO 處理過的細胞為陰性對照組，加入6 個質(zhì)量濃度（0、2、4、8、16、32μg/mL）的山竹不同極性部位。繼續(xù)37℃、5%CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h 后，每孔加入10μL CCK8 溶液，37℃繼續(xù)孵育1～4h 后，低速震蕩30s，使用酶標儀檢測細胞在450nm 處吸光度A 值，計算細胞存活率。

4.平板集落形成實驗。

取對數(shù)生長期的人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U251，分別用胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞，把細胞懸浮在含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中備用。將細胞接種于6 孔板中，每孔接種500 個細胞，使細胞分散均勻。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 周；經(jīng)常觀察，當培養(yǎng)板中出現(xiàn)肉眼可見的細胞集落時，終止培養(yǎng)，棄去上清液；用PBS 小心浸洗2 次。用4℃預冷的甲醛固定細胞作用15min；然后吸走固定液,加適量0.5%的結(jié)晶紫染色20min，然后用雙蒸水洗去染色液,空氣干燥后倒置6 孔板并拍照記錄。實驗重復3 次。

5.數(shù)據(jù)處理。

所有實驗均平行操作3 次，試驗結(jié)果均表示為“平均值±標準偏差”。數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism5 軟件進行統(tǒng)計學分析，采用ANOVA 進行顯著性分析。

二、結(jié)果與分析

（一）山竹果皮總提取物對U251 細胞的CCK-8 結(jié)果

使用CCK-8 法檢測不同濃度山竹果皮提取物對U251 細胞作用48h 和72h 后的生長抑制率，圖1 結(jié)果顯示，48h 后隨著藥物濃度增大，山竹果皮總提取物對細胞增殖抑制作用呈現(xiàn)升高趨勢；藥物作用72h 后的抑制作用有所提高。本實驗山竹果皮總提取物48h IC50值為9.49μg/mL，72h IC50值為7.98μg/mL。

（二）山竹果皮總?cè)∥飳251 細胞集落形成實驗結(jié)果

通過細胞集落形成實驗進一步觀察山竹果皮總提取物對細胞增殖抑制效果，如圖2 結(jié)果顯示，隨著藥物濃度提高，細胞集落克隆形成數(shù)減少，藥物抑制效果越明顯。

三、結(jié)語

本研究采用了CCK-8 實驗與細胞集落形成實驗測定了山竹果皮總提取物對人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U251 增殖能力的影響。此次體外抗腫瘤活性試驗結(jié)果表明山竹過果皮總提取物在對人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U251 增殖有抑制作用，隨著藥物濃度的升高，細胞的存活率相應降低。48h IC50 為9.49μg/mL，72hIC50 為7.98μg/mL，72h IC50 值比48h IC50 值有所降低，說明山竹果皮提取物具有一定的時效性。此次細胞集落形成實驗進一步表明了山竹果皮總提取物對U251 細胞的增殖有抑制作用。山竹果皮總提取物在抗腫瘤方面具有不錯的藥用價值，其作用機制有待進一步研究，本研究結(jié)果對抗U251 腫瘤細胞新藥的研發(fā)提供了一定幫助。