劉芳馨，黃 鑫，張 濤，王恩鵬，鮑慧瑋，周 嶸，陳長寶

（長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院·吉林長春·130117）

北細(xì)辛為馬兜鈴科植物北細(xì)辛Asarum heterotropoides Fr. Schmidt var. mandshuricum （Maxim.）Kitag.的干燥根及根莖，主產(chǎn)于遼寧的撫順、丹東、吉林長白山以及黑龍江等地。北細(xì)辛具有解表散寒、祛風(fēng)止痛、通竅、溫肺化飲等功效[1]。 北細(xì)辛中化學(xué)成分較復(fù)雜，包括揮發(fā)性的甲基丁香酚、細(xì)辛脂素、黃樟醚、欖香素等以及木脂素類的細(xì)辛脂素和痕量的馬兜鈴酸[2]。其中甲基丁香酚因其具有降血壓、鎮(zhèn)咳、祛痰、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等作用[3-5]，但甲基丁香酚的代謝產(chǎn)物具有化學(xué)反應(yīng)活性，其對機(jī)體有致癌和對機(jī)體呼吸中樞有抑制作用，有較強(qiáng)的毒副作用[6-8]。因此，檢測北細(xì)辛藥材中甲基丁香酚的含量為以后更加安全有效地使用中藥北細(xì)辛提供一定的科學(xué)理論基礎(chǔ)。

根據(jù)文獻(xiàn)報道， 對北細(xì)辛藥材中甲基丁香酚含量的測定方法主要包括色譜法、高效毛細(xì)管電泳法[9]和紫外吸收光譜法[10]，其中色譜法主要采用紫外檢測器[11-12]，尚沒有報道應(yīng)用熒光檢測器分析北細(xì)辛藥材中甲基丁香酚含量。 而甲基丁香酚具有的熒光吸收較強(qiáng)的苯環(huán)結(jié)構(gòu)，故本文建立一種HPLC-FLD 法測定中藥材北細(xì)辛中甲基丁香酚的含量，專屬性強(qiáng)，靈敏度高[13-14]，可快速、準(zhǔn)確的評價北細(xì)辛的質(zhì)量。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Agilent 1100 型高效液相色譜儀；KQ-250 型雙頻數(shù)控超聲波清洗器 （購自昆山市超聲儀器有限公司）；FA1004B 型萬分之一分析天平（購自上海佑科儀器儀表有限公司）；DFY-500 搖擺式多功能高速中藥粉碎機(jī)（購自溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司）；SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵（購自上?？粕齼x器有限公司）。

1.2 試劑與試藥

北細(xì)辛為馬兜鈴科植物北細(xì)辛Asarum heterotropoides Fr. Schmidt var. mandshuricum （Maxim.）Kitag.的根及根莖，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)蔡廣知副教授鑒定符合《中國藥典》2020 年版一部項(xiàng)下規(guī)定；甲基丁香酚（批號：111642-200301），購自中國食品藥品檢定研究院；HPLC 分析中的甲醇 （批號：20200506） 和乙腈（批號：20200501）均為色譜級，購自美國Fisher 公司；超純水購自杭州娃哈哈有限公司。

2 方法

2.1 色譜條件

采用Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～15min，35%A；15～35min，35%→50%A）； 激發(fā)波長為270 nm；發(fā)射波長為312nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為20μL。

圖1 北細(xì)辛藥材HPLC-FLD 色譜圖（A.對照品溶液；B.供試品溶液；1.甲基丁香酚）Figure 1 HPLC-FLD chromatograms of North Asarum (A.reference solution; B. sample solution;1. methyleugenol)

2.2 對照品溶液的制備

取甲基丁香酚對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解定容至10mL，作為甲基丁香酚對照品母液；再精密移取1mL，用甲醇稀釋定容至10mL，制成1mL 含10.1μg甲基丁香酚的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取北細(xì)辛藥材粉末（過六號篩）約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率500W，頻率40kHz）40 分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

移取“2.2” 項(xiàng)下甲基丁香酚對照品母液，分別用甲醇稀釋0、2、4、10、20、100 倍，作為系列對照品溶液，按“2.1” 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣分析。 以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），甲基丁香酚濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 得到回歸方程為Y=4500X-1010.1（r=0.9997），表明甲基丁香酚在1.01～101μg/mL 濃度范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.3” 項(xiàng)下北細(xì)辛供試品溶液，按照“2.1” 項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次，計算得到甲基丁香酚色譜峰面積的RSD 值為0.55%，說明該儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取批號為20200901 的北細(xì)辛藥材，粉碎，過六號篩，精密稱取0.5g 粉末，按“2.3” 項(xiàng)下方法操作，平行制備6 份供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。計算得到北細(xì)辛供試品中甲基丁香酚的平均含量為0.085%，RSD 值為1.25%， 說明該制備方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.3” 項(xiàng)下北細(xì)辛供試品溶液，置于室溫，分別于0、2、4、6、8、12、24h，注入高效液相色譜儀中進(jìn)行分析， 計算得到甲基丁香酚色譜峰面積的RSD 值為0.93%，說明制備的北細(xì)辛供試品溶液在24h 內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.8 加樣回收試驗(yàn)

取甲基丁香酚對照品約4mg，精密稱定，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，搖勻，作為加樣回收試驗(yàn)的對照品溶液。 取已知含量的批號為20200901 的北細(xì)辛藥材，粉碎，過六號篩，稱取粉末6 份，每份約0.25g，分別置25mL 具塞錐形瓶中，再精密移取上述對照品溶液0.4mL，按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液。在“2.1” 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Experimental results of sample recovery

2.9 含量測定

分別取9 批北細(xì)辛藥材，按照“2.3” 項(xiàng)下處理樣品，制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行分析，記錄甲基丁香酚色譜峰面積。 采用外標(biāo)法計算北細(xì)辛藥材中甲基丁香酚含量。 結(jié)果見表2。

表2 北細(xì)辛藥材中甲基丁香酚含量（%）Table 2 Content of methyleugenol in North Asarum(%)

3 結(jié)論與討論

通過上述實(shí)驗(yàn)研究表明，采用熒光檢測器測定時，本身具有較好的靈敏度及準(zhǔn)確度， 且甲基丁香酚具有熒光吸收特性，又具備良好的專屬性，能滿足北細(xì)辛藥材中甲基丁香酚含量的測定， 可作為北細(xì)辛藥材質(zhì)量控制的參考方法。

本文對色譜分析條件進(jìn)行了考察。首先，與紫外檢測器進(jìn)行比較。 采用紫外檢測器測定時[15-16]，北細(xì)辛供試品的雜質(zhì)峰較多，專屬性不強(qiáng)，靈敏度低，考慮到甲基丁香酚特有的苯環(huán)結(jié)構(gòu)， 故采用熒光檢測器進(jìn)行分析；其次，進(jìn)行了流動相的篩選。 當(dāng)采用甲醇-水和乙腈-水進(jìn)行洗脫時[17-18]，甲基丁香酚色譜峰的峰形不對稱，拖尾較嚴(yán)重，當(dāng)流動相體系更換成乙腈-0.1%磷酸溶液時，拖尾現(xiàn)象得到改善，故選用乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動相；最后，對洗脫條件進(jìn)行考察。采用乙腈-0.1%磷酸溶液等度洗脫時，待測色譜峰與相鄰色譜峰不能完成分離，更換梯度洗脫程序后，分離完全，可更準(zhǔn)確的分析甲基丁香酚含量。