贠張君，王慧靜，孫梓宜，劉鑫源，姚樹坤

（1.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院，北京 100029）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種原因不明的彌漫性非特異性炎性疾病，持續(xù)影響直腸近端的結腸黏膜并經(jīng)常形成糜爛和或潰瘍[1]，屬炎癥性腸?。↖BD）的一種。據(jù)報道，在過去的20年中，由于生活方式及飲食結構的西方化，我國UC的發(fā)病率和患病率逐年攀升并呈現(xiàn)年輕化趨勢[2]。UC的發(fā)病有顯著的種族和地域差異，發(fā)病率和患病率最高區(qū)域主要集中于北歐，而在我國近20年來患病率有上升趨勢[3]。有學者[4]通過統(tǒng)計1981—2000年國內報道的10 218例UC患者，發(fā)現(xiàn)近10年患病人數(shù)增加了3.08倍。因UC病程長、易復發(fā)、難治愈、大大降低患者生活質量等特點，世界衛(wèi)生組織將其列為難治愈性疾病。雖然對其發(fā)病機理已有一定認識，但其病因尚不明確，目前大多認為與遺傳、感染、環(huán)境因素和腸黏膜免疫有關[5]。常規(guī)治療手段主要為水楊酸制劑、皮質類固醇和免疫抑制劑一類抑制促炎反應來緩解病情，但病情易反復，不良反應明顯，如骨質疏松癥、肥胖、胰島素抵抗、癌癥和結核病風險增加[6-7]。因此，尋找UC的替代性治療藥物已成為一種研究趨勢。

以整體觀念和辨證論治為特點的中醫(yī)學在診治慢性難治性疾病方面具有一定優(yōu)勢。根據(jù)其臨床特點，中醫(yī)學將 UC 歸于“泄瀉”“腸風”“臟毒”等范疇[8]，病因主要為先天稟賦不足、素體脾虛、飲食不節(jié)、情志失調等。大腸濕熱證、脾虛濕蘊證、寒熱錯雜證、肝郁脾虛證為主要證型[9]。近年來，隨著國民生活水平的提高和飲食結構的西方化，進食過多的辛辣、油炸、燒烤等刺激性食物導致濕熱體質盛行，現(xiàn)代疾病證候以實證、熱證居多，虛證、寒證較少，病證常常虛實夾雜，寒熱錯雜。結合查找研究文獻，發(fā)現(xiàn)大腸濕熱證為UC的中醫(yī)常見證候[10-11]。葛根芩連湯為治療身熱下利的經(jīng)典名方，方中葛根既能解表退熱，又可升脾胃清陽而止瀉，輔以黃芩、黃連清熱燥濕以厚腸止利?，F(xiàn)多用于治療以濕熱蘊結大腸為基本病機的泄瀉，而UC早期多表現(xiàn)為黏液性膿血便。此外，已有大量研究顯示葛根芩連湯治療UC效果顯著，但對其作用機制研究較少或集中于單一通路，缺乏系統(tǒng)性分析。如秦凱健[12]等人通過系統(tǒng)性評價葛根芩連湯加減與柳氮磺吡啶治療381例UC患者，顯示聯(lián)合葛根芩連湯加減可提高治療總有效率；王浩、徐明[13]等人通過大鼠模型證明，葛根芩連湯可通過上調Bcl-2水平、下調Bax水平，保護結腸黏膜而治療UC；還有學者[14]表明葛根芩連湯可降低NO、IL-18的水平，促進血漿SOD、IL-4的表達，從而發(fā)揮抗氧化損傷、抗炎等作用治療UC。

網(wǎng)絡藥理學是對疾病、蛋白靶標、藥物的相互作用網(wǎng)絡系統(tǒng)分析，其系統(tǒng)生物學的理念與中醫(yī)學的整體觀念不謀而合[15-16]。其通過構建藥物分子-靶點-疾病生物網(wǎng)絡，分析三者在網(wǎng)絡中的相互作用，探索作用機制[17]。本文將通過構建“藥物-靶點-疾病”相互作用網(wǎng)絡，并結合GO富集分析和KEGG通路分析探討葛根芩連湯治療UC的多成分-多靶點-多信號通路特點，分子對接驗證其藥物活性，為UC的新藥研發(fā)及機制研究提供思路及方向。

1 材料與方法

1.1 葛根芩連湯有效成分及候選靶點篩選 葛根芩連湯組成中葛根、黃芩、黃連、甘草的有效化學成分通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）[18]檢索。為了篩選出容易吸收、成藥的化學成分，根據(jù)毒藥物動力學ADME參數(shù)進行篩選，篩選條件為OB（口服生物利用度）≥30%和DL（類藥性）≥0.18。其中OB是指藥物吸收進入人體循環(huán)的速度和程度；DL指化合物與已知藥物的相似性。將篩選出來的化學成分導入數(shù)據(jù)庫PharmMapper sever（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/index.html）中，通過反向藥效團匹配技術預測化合物的候選靶點，物種類限定為人類。最后將上述靶點在 UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）中標準化為基因名。

1.2 UC疾病相關靶點的檢索與篩選 通過藥物靶標數(shù)據(jù)庫 DrugBank[19]（https：//www.drugbank.ca/）、靶點數(shù)據(jù)庫TTD[20]（http：//db.idrblab.net/ttd/）、基因疾病關聯(lián)數(shù)據(jù)庫 DisGeNET[21]（https：//www.disgenet.org/）檢索UC相關靶點，刪除重復基因后，獲得UC疾病的相關靶點。

1.3 葛根芩連湯作用靶點的預測 應用R VeenDiagram程序包對上述疾病與藥物靶標取交集，獲得葛根芩連湯作用于UC的靶點蛋白。

1.4 蛋白互作（protein proteininteraction，PPI）網(wǎng)絡的構建與拓撲分析 將藥物-疾病交集靶點導入STRING （https：//string-db.org/，Version11.0）[22]數(shù)據(jù)庫，Organism 設定為“Homo sapiens”，為了保證數(shù)據(jù)的高可信度，在“Settings”中設置分數(shù)選擇為0.9，隱藏網(wǎng)絡中斷開連接的節(jié)點，即可得到蛋白互作網(wǎng)絡圖，并將上述文件導入Cytoscape3.7.1軟件中進行可視化網(wǎng)絡拓撲分析。

1.5 構建“藥物-有效成分-靶點”網(wǎng)絡 將整理出的葛根芩連湯化學成分與UC相關的疾病靶點映射出共同靶點，導入Cytoscape3.7.1軟件，構建“藥物-有效成分-靶點”網(wǎng)絡圖。其中節(jié)點（node）分別代表藥物、有效成分和潛在靶點，邊（edg）表明三者之間的關系。

1.6 分子對接驗證 PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）搜索藥物小分子2D結構，應用ChemBioOffice Ultra 2014 Wizard軟件優(yōu)化為3D結構并統(tǒng)一保存為mol2格式。靶點蛋白的3D結構從PDB數(shù)據(jù)庫中收集，使用PyMOL軟件去除水分子和配體分子，應用AutoDockTools1.5.6對蛋白加氫、加電荷，使用命令提示符（CMD vina）進行分子對接，最后利用PyMOL可視化處理。

1.7 GO富集分析與KEGG通路分析 將上述葛根芩連湯與UC交集靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫（DAVID 6.8，https：//david.ncifcrf.gov/），物種限定為“人類”，進行GO富集分析及KEGG通路富集分析，篩選p<0.05的結果，導入R語言進行氣泡圖制作，并檢索相關文獻，對主要通路進行討論。

2 結果

2.1 藥物及疾病靶點獲取 通過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫得到146個有效化學成分，240個藥物靶點。其中，個別化學成分存在兩種藥物當中，如芒柄花黃素（formononetin）存在于葛根、甘草中，β-谷甾醇（betasitosterol）存在于葛根、黃芩中；黃連堿（coptisine）存在于黃芩、黃連中；表小檗堿（epiberberine）存在于黃芩、黃連中；槲皮素（quercetin）存在于黃連、甘草中，反應出葛根芩連湯多成分多靶點的網(wǎng)絡效應。TTD、Drugbank、DisGeNET數(shù)據(jù)庫共收集1 665個疾病靶點，標準化基因名并剔除重復值，最后得到1 382疾病靶點。

2.2 葛根芩連湯的潛在作用靶點 將獲得的藥物靶點與疾病靶點，通過R VeenDiagram程序包映射后，得到114個“藥物-疾病”共同基因，因此，葛根芩連湯可能通過114個交集基因的協(xié)同作用治療UC。詳見圖1。

圖1 藥物-疾病交集基因Venny圖

2.3 PPI核心網(wǎng)絡構建與拓撲分析 將114個基因導入到STRING數(shù)據(jù)庫中，顯示114個節(jié)點（靶點蛋白）和354個邊緣（蛋白相互作用），平均節(jié)點度6.21，節(jié)點為蛋白，線條為蛋白間的相互作用關系，詳見圖2。應用Cytoscape3.7.1軟件中進行網(wǎng)絡拓撲分析，計算 Degree、Betweenness、Closeness、Eigenvector、LAC值，篩選出高于每個條件中位值的基因，Degree值前10 的蛋白為 MAPK3、MAPK1、STAT3、FOS、MAPK14、ESR1、IL2、RELA、MYC、MAPK8，這些蛋白可能在葛根芩連湯治療UC發(fā)中發(fā)揮重要作用，見圖3。

圖2 葛根芩連湯治療UC的PPI網(wǎng)絡潛在靶點

圖3 PPI網(wǎng)絡核心蛋白

2.4 藥物-有效成分-靶點網(wǎng)絡構建分析 通過Cytoscape3.7.1軟件建立藥物-有效成分-靶點網(wǎng)絡，如圖4，一個有效成分可作用于多種靶點，如來源于甘草、黃連的橡黃素（Quercetin）與84個靶點相連；多種活性成分可共同作用于一個靶點，例如靶點PTGS2、CALM1、HSP90AA1、ESR1、NOS2、PTGS1、PPARG、ESR2與60個以上有效成分連接，反應出葛根芩連湯多成分、多靶點的協(xié)同作用。通過Cytoscape3.7.1分析后顯示出關聯(lián)強度較大的藥物化學成分有橡黃素、山柰酚、漢黃芩素、柚皮素、黃芩素、甘草查爾酮A等，上述成分可能為葛根芩連湯治療UC的重要活性成分。

圖4 藥物-有效成分-靶點網(wǎng)絡

2.5 分子對接模擬驗證結果 將PPI核心網(wǎng)絡中Degree值排名前12的靶點作為蛋白受體，藥物-有效成分-靶點網(wǎng)絡拓撲分析顯示關聯(lián)強度較大的前6的化學成分：甘草查爾酮A（MOL000497）、槲黃素（MOL000098）、漢黃芩素 （MOL000173）、柚皮素（MOL004328）、 黃 芩 素 （MOL002714）、 山 柰 酚（MOL000422）作為小分子配體，使用匹配原則算法來預測其結合模式及親和力。以結合能作為篩選條件，配體與受體結合能量越低，代表相互作用關系越強烈，結合能≤-5.0 kcal/moL表示有較強親和力[23-24]。共得到25個對接結果，如表1所示，強親和力對接結果如圖5所示，結果表明潛在靶點與有效成分有較強的結合力。

圖5 核心靶點與活性成分對接模式

表1 核心靶點與活性成分結合能

2.6 GO功能富集分析 應用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫對114個核心靶點進行GO富集分析，共得到599條結果，并以P值進行排序，篩選出P<0.05的生物學過程，運用R語言選取BP、CC、MF的前20繪制氣泡圖（圖6-圖8）。GO富集分析分為3類：生物過程（biological process，BP）、細胞組成（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）。其中以 BP條目最多，451個，主要涉及RNA聚合酶II啟動子轉錄的正調控、凋亡過程負調控、炎癥反應、細胞增殖的正調控、氧化還原反應、缺氧反應、免疫反應等方面；CC相關條目48條，主要分布于核、細胞質、細胞外空間等方面；MF相關條目100條，主要涉及蛋白結合、蛋白質同型二聚體活性等方面。綜上，GO分析結果顯示葛根芩連湯可涉及炎癥、免疫、氧化還原反應、細胞增殖及凋亡、低氧反應等多個環(huán)節(jié)發(fā)揮治療作用。2.7 KEGG通路富集分析 應用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫對114個核心靶點進行KEGG通路富集分析，獲得117條結果。應用R語言軟件富集出前20個KEGG通路（見圖9），如癌癥通路、磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶 B（PI3K-Akt）信號通路、缺氧誘導因子-1（HIF-1）通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路、Toll受體（Toll-like receptor）及叉頭轉錄因子（FoxO）信號通路、Ras信號通路等多個信號通路，表示葛根芩連湯通過多個信號通路協(xié)同發(fā)揮作用。

圖6 生物過程的富集分析氣泡圖

圖7 細胞組成的富集分析氣泡圖

圖8 分子功能的富集分析氣泡圖

圖9 KEGG通路的富集分析氣泡圖

3 討論

本研究共篩選出葛根芩連湯146個有效化學成分，240個藥物靶點，1 382疾病蛋白。首先，通過藥物-有效成分-靶點網(wǎng)絡構建，顯示出關聯(lián)強度較大的藥物化學成分有橡黃素、山柰酚、漢黃芩素、柚皮素、黃芩素、甘草查爾酮A等，上述成分為葛根芩連湯治療UC的重要活性成分。腸上皮細胞與免疫細胞構成了腸道屏障，共同維持腸道微環(huán)境的穩(wěn)定。炎癥反應和腸黏膜修復因子損傷介導了UC的發(fā)生發(fā)展。有文獻顯示橡黃素[25]可通過上調Arg-1同時抑制IL-17A，促進腸粘膜修復因子的表達而改善腸道炎癥狀態(tài)；而山柰酚具有抗炎、抗菌、抗腫瘤等多種藥理作用，其可通過阻滯細胞周期于G2/M期、作用于PI3K-Akt發(fā)揮效用[26-27]；柚皮素可下調總谷胱甘肽硫代肽（T-GSH）、非蛋白硫代肽（NP-SH），促進腸上皮黏液分泌從而產生對炎癥性腸病的保護作用[28]。另有研究表明[29]，黃芩素干預的大鼠模型中，NF-κB和MAPK表達水平顯著降低，NF-κB與MAPK的激活可誘發(fā)嚴重的炎癥瀑布；甘草查爾酮A[30]則可通過抑制NF-κB，提高Nrf2水平，降低氧化應激和炎癥因子表達，從而緩解UC腸粘膜炎癥。因此，推測葛根芩連湯可通過抑制炎癥反應、促進粘膜修復因子的表達來緩解UC的發(fā)生發(fā)展。其次，通過網(wǎng)絡拓撲分析顯示 PTGS2、CALM1、HSP90AA1、ESR1、NOS2、PTGS1、PPARG、ESR2與60個以上有效成分連接，這些可能是葛根芩連湯治療UC的關鍵靶點，其中ESR1[31]、PTGS2[32]、PPARG[32]、NOS2[33]已被學者證實是 UC 的重要靶點，但其他相關性極高的靶點CALM1、HSP90AA1等為本研究首次發(fā)現(xiàn)，這可為進一步研究UC的作用機制提供新的參考方向。

GO富集分析結果顯示，葛根芩連湯活性成分主要富集在RNA聚合酶II、細胞增殖及凋亡、炎癥反應、免疫反應、氧化還原反應、低氧反應等生物學過程，其中炎癥及免疫反應介導UC發(fā)生發(fā)展與大多數(shù)既往學者觀點一致。RNA聚合酶II與幽門螺旋桿菌感染誘導特異性基因的甲基化有關，而甲基化水平與黏膜癌變風險相關[34]。“生理性缺氧”是低氧水平的腸黏膜特征，是正常上皮細胞生理的原因和結果，而“病理性低氧”則是腸黏膜活動性炎癥的標志[35]，HIF[36]是低氧反應的主調節(jié)因子。正常微環(huán)境中，HIF-α可被蛋白酶降解，在缺氧狀態(tài)，HIF可上調VEGF、iNOS、EPO等多種靶基因，使機體適應缺氧環(huán)境而緩解黏膜炎癥[37]。體內重要的代謝途徑都需要氧氣的參與，組織病理性缺氧和局部炎癥反應幾乎是同時發(fā)生的[38]。攜氧的炎癥細胞聚集黏附可導致局部氧耗盡誘發(fā)炎癥，而炎癥反應致使微血管損傷，可進一步加重局部組織的灌注不足而造成炎癥的惡性循環(huán)[39-41]。因此，葛根芩連湯可能通過改善腸黏膜局部氧供緩解腸粘膜炎癥，作用于RNA聚合酶II而降低黏膜癌變風險。

KEGG通路富集分析顯示，主要涉及通路包括Cancer、PI3K-AKT、HIF-1、MAPK、TOLL 受體等多個信號通路。UC患者癌變風險與病程呈正相關，這與結直腸黏膜的長期慢性炎癥相關。癌變的發(fā)生源于“反復炎癥—不典型增生—癌變”三部曲，反復的炎癥和腸黏膜的損傷-修復，釀成了易于腫瘤生長的微環(huán)境[42]。研究表明，癌癥通路涵蓋了本文所提出的FoxO[43]、Ras-MAPK[43]、TOLL 受體[44]、HIF[45]等多個信號通路。研究表明，F(xiàn)oxO3可上調NF-κBp50損害腸黏膜屏障使炎癥持續(xù)存在增高癌變風險[46]。Toll-like receptor 4通過調節(jié)ACA-T1抑制腸癌細胞的侵襲和擴散，下調MAPK-HIF-α-VEGF途徑可抑制腫瘤血管生成，延緩腫瘤進展[45]。這表明葛根芩連湯可能在延緩UC向大腸癌進展過程中扮有重要角色。其次，TNF和TNFR超家族在介導細胞分化、生成、凋亡、炎癥、免疫調節(jié)等方面發(fā)揮了重要作用[47]。其中，TNF-α是一種在腸黏膜固有層高度表達的促炎因子，在增加腸黏膜的通透性、造成局部的損傷和炎癥反應、促進血栓形成等方面起有重要作用，并介導NF-κB、MAPK、Toll樣受體4等多個信號通路[48-50]。目前，TNF單抗已經(jīng)應用于臨床治療重度UC，并得到廣泛認可，這與本文得到的TNF通路一致。另有學者表明，黃芩湯[51]通過抑制Ras-P13K-Akt-HIF-1α和NF-κB通路、調節(jié)TLR4和GPCR抑制Ras信號通路，從而下調炎癥因子，緩解腸黏膜炎癥。因此，我們推測，葛根芩連湯可能通過作用于Ras-P13K-Akt-HIF-1α、TLR4-Ras信號通路發(fā)揮抗炎、作用于MAPK-HIF-α-VEGF延緩腫瘤進展等作用。

本研究通過網(wǎng)絡藥理學和既往研究基礎，揭示了葛根芩連湯治療UC的多成分、多靶點、多通路的網(wǎng)絡作用，主要與相關通路介導的抗炎、抗氧化損傷、低氧反應、阻滯細胞周期延緩腫瘤進展等效應有關。目前多項研究表明中醫(yī)學的濕熱證與現(xiàn)代醫(yī)學的慢性炎癥高度一致，中醫(yī)學清熱祛濕法相當于現(xiàn)代醫(yī)學抗炎治療，這與本研究顯示葛根芩連湯作用于多個經(jīng)典炎癥通路相符。然而本研究不足之處在于，僅是對葛根芩連湯治療UC機制的理論層面探討，不能精確地闡述和證實上述通路在體內的具體代謝機制，未來還需通過動物實驗進一步驗證。