王紅娟，胡雯，雷子賢，康曉靜

（新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚性病科，新疆皮膚病研究重點實驗室，烏魯木齊 830001）

白癜風(fēng)是一種慢性炎癥性疾病，其特征是表皮黑色素細(xì)胞丟失引起的皮膚脫色。白癜風(fēng)中黑色素細(xì)胞的破壞已被歸因于多種病因?qū)W理論，氧化應(yīng)激的發(fā)生和CD8+T細(xì)胞毒性的產(chǎn)生可直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和分化[1,2]。白癜風(fēng)的病因和發(fā)病機制尚不明確，較多學(xué)者支持氧化應(yīng)激理論，氧化應(yīng)激在白癜風(fēng)的發(fā)生以及發(fā)展中起著重要的作用，可能破壞黑素細(xì)胞[3,4]，黑素細(xì)胞釋放的HMGB1有助于形成氧化應(yīng)激引起的白癜風(fēng)自身免疫[5]。最近研究證明氧化應(yīng)激有助于暴露源自黑素細(xì)胞的自身抗原，此外，氧化應(yīng)激會促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞分泌促動素，從而介導(dǎo)皮膚白細(xì)胞病變中T細(xì)胞的浸潤[6]。異鼠李素（isorhamnetin, ISO）屬于黃酮類化合物，可抑制乙酰膽堿酯酶活性、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和炎癥[7]。ISO可通過激活Nrf2并促使其下游靶基因（ERK1/2, PKCδ和 AMPK）的表達(dá)來發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用[8]。目前關(guān)于ISO對人表皮黑素細(xì)胞抗氧化作用的研究未見報道，本實驗初步研究在體外人表皮黑素細(xì)胞培養(yǎng)條件下，用ISO預(yù)處理黑素細(xì)胞，H2O2誘導(dǎo)人表皮黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，通過對黑素細(xì)胞增殖、黑素合成的檢測，研究ISO對黑素細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用及對黑素合成的影響。

材料與方法

1 材料

M2黑素細(xì)胞生長培養(yǎng)基DEMEM/F12，含5ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）（Promocell公司），0.25%胰酶（含0.02%EDTA）。異鼠李素（中國食品藥品檢定研究院），30% H2O2原液（美國sigma公司），二甲基亞砜（DMSO）（美國sigma公司），CCK-8試劑（日本Dojindo公司），左旋多巴（美國Sigma公司），活性氧檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

2 黑素細(xì)胞培養(yǎng)

選用表皮分離吸皰儀在白癜風(fēng)患者腹部吸皰6個（負(fù)壓50 kPa，時間60~90min，每個皰直徑0.8cm），待發(fā)皰看起來透亮后，用注射器將皰液吸出，注入5ml離心管中，0.22μm針頭濾器過濾，-20℃保存。將皰壁沿基底邊緣剪下，加入含青霉素及鏈霉素100U/ml的PBS，常溫放置10min，PBS洗2~3次，將PBS吸干凈，組織盡量剪碎，加入0.25%胰酶0.5ml，4℃消化12~16h后，黑素細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化，吹打使細(xì)胞分散混濁，1500r/min離心3min棄上清，PBS洗2~3次，加入M2黑素細(xì)胞選擇性培養(yǎng)基，置37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每3d更換培養(yǎng)基1次，并在顯微鏡下觀察原代黑素細(xì)胞貼壁及生長狀況，當(dāng)黑素細(xì)胞達(dá)到80%以上融合后，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

3 黑素細(xì)胞增殖的測定

將傳代細(xì)胞的濃度調(diào)整至1×104個/孔后加入96孔培養(yǎng)板，每孔150μl；24h細(xì)胞貼壁后吸去培養(yǎng)液，加入PBS，用10、20、40、60、80、100μmol/L的異鼠李素處理黑素細(xì)胞，并設(shè)立空白和陰性對照組，每一處理因素設(shè)立3個復(fù)孔，置37℃、5%C02條件下繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h；于結(jié)束前4h，加入CCK-8液10ul/孔；置酶標(biāo)儀于490nm波長測吸收光光度值；細(xì)胞增殖率=（樣本組吸光度值-空白組吸光度值）/（對照組吸光度值-空白組吸光度值）×l00%。

4 H2O2誘導(dǎo)黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激模型濃度篩選

將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞消化，細(xì)胞計數(shù)后，細(xì)胞密度為 1×104個/ml，接種于96孔板中，每孔150μl，板周圍一圈加 PBS100μl,以避免邊緣效應(yīng)，放入37℃，5%CO2，濕度95%以上的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁進(jìn)入對數(shù)生長期時加入含有不同濃度 H2O2的培養(yǎng)液 200μl，濃度分別為0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.8mmol/L和1.6mmol/L，對照組為培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。按照 CCK-8 試劑盒操作步驟測定細(xì)胞活力，選取黑素細(xì)胞活力在50%（IC50）的 H2O2濃度進(jìn)行后續(xù)實驗。

5 ISO對人表皮黑素細(xì)胞增殖測定

將黑素細(xì)胞的濃度調(diào)整至1×104個/孔后加入96孔培養(yǎng)板，每孔150μl，細(xì)胞貼壁后吸棄培養(yǎng)基，用培養(yǎng)基中含有 10、20、40、60、80、100μmol/L 的ISO處理黑素細(xì)胞，并設(shè)空白和陰性對照組，每一處理因素設(shè)4個復(fù)孔，置37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h后加入CCK-8液（10μl/孔），置酶標(biāo)儀于490nm波長測各孔OD值。

6 ISO對H2O2誘導(dǎo)下人表皮黑素細(xì)胞增殖測定

將黑素細(xì)胞的濃度調(diào)整至1×104個/孔后加入96孔培養(yǎng)板，每孔150μl；24h細(xì)胞貼壁后吸去培養(yǎng)液，加入PBS，用預(yù)定劑量ISO預(yù)處理黑素細(xì)胞，并設(shè)立空白和陰性對照組，每一處理因素設(shè)立4個復(fù)孔，置37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24h，換液加入一定濃度的H2O2，共培養(yǎng)24h后，加入CCK-8液（10μl/孔）；置酶標(biāo)儀于490nm波長測各孔OD值。

7 NaOH裂解法測定黑素含量

選擇對數(shù)生長期細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液后加入6孔板，每孔2×105個；24h細(xì)胞貼壁后吸去培養(yǎng)液，加入PBS，用預(yù)定劑量ISO處理黑素細(xì)胞，并設(shè)空白和陰性對照組，置37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)72h；72h后棄上清液，收集細(xì)胞，血細(xì)胞計數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)（重復(fù)3次取平均值）；然后PBS洗滌2次，重新溶解于1mol/L NaOH 500μl；80℃烘箱2h后，將1mol/L NaOH加入96孔板，每孔 100μl，設(shè)4個復(fù)孔，置酶標(biāo)儀于405nm波長測吸光度值：黑素含量=各孔吸光度值/各孔細(xì)胞密度。

8 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧水平

選擇對數(shù)生長期細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液后加入6孔板，每孔2×105個；24h細(xì)胞貼壁后吸去培養(yǎng)液，加入PBS，用預(yù)定劑量ISO處理黑素細(xì)胞，并設(shè)空白和陰性對照組，置37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24h，換液加入一定濃度的H2O2，共培養(yǎng)24h后，加入10μmol/L 二氯二氫熒光素二乙酸酯（2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate, DCFH-DA）探針，孵育30min，PBS洗3次，收集細(xì)胞，250μl PBS重懸細(xì)胞，移入 5ml 流式管中，使用 488nm 激發(fā)波長，525nm 發(fā)射波長，空白組細(xì)胞調(diào)零，流式細(xì)胞儀檢測實驗組細(xì)胞內(nèi)的DCF熒光強度。

9 統(tǒng)計學(xué)分析

使用GraphPad Prism 7軟件對實驗結(jié)果作圖,數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 原代培養(yǎng)黑素細(xì)胞的形態(tài)

原代培養(yǎng)的黑素細(xì)胞每間隔2d換液一次，M2培養(yǎng)基可選擇性地殺傷成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞，對黑素細(xì)胞無影響。培養(yǎng)1周左右，倒置顯微鏡下可觀察到呈梭型的黑素細(xì)胞，大部分細(xì)胞有2個樹突，少部分有3個樹突。由于表皮中黑素細(xì)胞含量較少，黑素細(xì)胞以點狀輻射狀生長， 不均勻地鋪在瓶底（圖1A）。約2周后，黑素細(xì)胞數(shù)量明顯增多，連接成網(wǎng)狀，達(dá)到90%以上融合，即可傳代（圖1B）。傳代后的黑素細(xì)胞形態(tài)呈長梭型，鏡下可觀察到正在分裂增殖的黑素細(xì)胞（圖1C）。

圖1 原代培養(yǎng)黑素細(xì)胞形態(tài)的倒置顯微鏡觀察。A，培養(yǎng)1周；B，培養(yǎng)2周；C，第1次傳代。比例尺，100μmFig. 1 Invert microscopic observation for the morphology of melanocytes. A, cultured for 1 week; B, cultured for 2 weeks; C, after the first passage;scale bar, 100μm

2 H2O2誘導(dǎo)黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激模型濃度篩選

CCK-8法分析顯示H2O2可濃度依賴性抑制黑素細(xì)胞活性：當(dāng)H2O2濃度為0.4mmol/L時，黑素細(xì)胞活性被抑制約25%；H2O2濃度在0.8mmol/L時，黑素細(xì)胞活性被抑制40%~50%；H2O2濃度在1.6mmol/L時，黑素細(xì)胞活性被抑制60%~80%（圖2）。細(xì)胞活性抑制率較低時（如25%左右）難以得到顯著的藥物作用，細(xì)胞活性抑制率過高時（如60%以上）較難得到藥物保護(hù)作用，細(xì)胞活力抑制率在40%~50%時能更有效的觀察藥物作用，因此H2O2濃度為 0.8mmol/L應(yīng)為最佳刺激條件。

圖2 H2O2對黑素細(xì)胞細(xì)胞活力影響的CCK-8法分析（24h）。與對照組比較：*0.01

3 ISO增強人表皮黑素細(xì)胞活性

不同濃度ISO處理黑素細(xì)胞不同時間后進(jìn)行CCK-8分析顯示：10 mmol/L、20μmol/L、40μmol/L、60μmol/L、80μmol/L及100μmol/L ISO處理黑素細(xì)胞24h和48h后，細(xì)胞活力無明顯變化；處理72h后，60μmol/L ISO可顯著增加黑素細(xì)胞活力（圖3）。

圖3 ISO對黑素細(xì)胞細(xì)胞活力影響的CCK-8分析。與對照組比較：*0.01

4 ISO抑制H2O2對人表皮黑素細(xì)胞的毒性

CCK-8法檢測顯示：60μmol/L ISO預(yù)處理24h再以0.8mmol/L H2O2處理24h或48h的人表皮黑素細(xì)胞，其活力顯著高于未用ISO預(yù)處理的0.8mmol/L H2O2刺激的細(xì)胞的活力（圖4），表明ISO對氧化應(yīng)激下黑素細(xì)胞具有保護(hù)作用。

圖4 ISO對H2O2人表皮黑素細(xì)胞活力抑制作用的影響。A，H2O2處理24h；B，H2O2處理48h。與對照組比較：*0.01

5 ISO雙向調(diào)節(jié)人表皮黑素細(xì)胞黑素合成

NaOH裂解法測定顯示，不同濃度ISO對人表皮黑素細(xì)胞合成黑素具有雙向調(diào)節(jié)作用：20μmol/L ISO抑制黑素細(xì)胞合成黑素，而80μmol/LISO對人表皮黑素細(xì)胞的黑素合成具有促進(jìn)作用，但當(dāng)ISO濃度進(jìn)一步升高時，黑素細(xì)胞黑素的合成又被抑制（圖5）。

圖5 ISO對人表皮黑素細(xì)胞黑素合成的影響。與對照組（0μmol/L ISO）比較：*0.01

6 ISO預(yù)處理對H2O2處理后人表皮黑素細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

采用DCFH-DA探針對ROS水平進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示：0.8mmol/L H2O2處理 24h 后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平較對照組顯著升高，而以60μmol/L ISO預(yù)處理24h再用0.8mmol/L H2O2處理細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)ROS水平的升高顯著減少（圖 6）。

圖6 ISO預(yù)處理對H2O2誘導(dǎo)人表皮黑素細(xì)胞ROS產(chǎn)生的影響。H2O2組 vs control組：*0.01

討 論

研究表明，氧化應(yīng)激在白癜風(fēng)的發(fā)病中起著至關(guān)重要的作用，處于進(jìn)展期白癜風(fēng)患者表皮中H2O2水平顯著升高[9]。白癜風(fēng)患者血漿中丙二醛、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶顯著高于正常人[10]，表明白癜風(fēng)患者體內(nèi)氧化—抗氧化平衡被打破，大量ROS在體內(nèi)蓄積導(dǎo)致表皮和真皮多種細(xì)胞出現(xiàn)氧化損傷。H2O2可使黑素細(xì)胞ROS含量增高，氧化應(yīng)激可能是引起黑素細(xì)胞凋亡的重要原因，而白癜風(fēng)皮損及皮損邊緣存在黑素細(xì)胞凋亡[11]。說明H2O2可激活黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激，可作為白癜風(fēng)氧化應(yīng)激模型。

通過預(yù)實驗，我們選擇4個H2O2濃度處理正常人表皮黑素細(xì)胞，檢測細(xì)胞活力發(fā)現(xiàn)，隨著H2O2濃度升高，黑素細(xì)胞活力呈逐漸下降趨勢，H2O2濃度為0.8mmol/L時下降較為明顯，但細(xì)胞活力仍保持在50%以上，說明此濃度下既可誘導(dǎo)黑素細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激狀態(tài)。因此，選擇H2O2濃度為0.8mmol/L作為最佳構(gòu)建正常人黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的條件。有研究報道，ISO對H2O2引起的H9C2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷有保護(hù)作用[12]，ISO通過增強抗氧化防御系統(tǒng)、膽堿能神經(jīng)傳遞和突觸可塑性而促進(jìn)潛在學(xué)習(xí)、記憶和認(rèn)知功能[13]。本研究選用不同濃度ISO和不同處理時間刺激黑素細(xì)胞，顯示ISO可促進(jìn)黑素細(xì)胞增殖，最終選用60μmol/LISO預(yù)處理黑素細(xì)胞。CCK-8法觀察ISO對0.8mmol/L H2O2誘導(dǎo)的細(xì)損害具有保護(hù)效應(yīng)，60μmol/L ISO預(yù)處理能顯著抑制H2O2降低人黑素細(xì)胞活力的作用，進(jìn)一步說明ISO具有抗氧化作用。

黑色素細(xì)胞起源于神經(jīng)嵴，占表皮細(xì)胞8%[14]。黑素細(xì)胞合成黑素，黑色素生成以后從黑色素細(xì)胞的樹突傳遞至角質(zhì)形成細(xì)胞[15]。在B16F10細(xì)胞中，ISO可顯著增加黑素生物合成基因MC1R、MITF、TYR、TYRP1和DCT的表達(dá)及提高酪氨酸酶活性[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的ISO對人表皮黑素細(xì)胞的黑素合成具有抑制作用，隨著ISO濃度的增高，人表皮黑素細(xì)胞的黑素含量也增高，80μmol/L時人表皮黑素細(xì)胞的黑素含量高于對照組。160μmol/L人表皮黑素細(xì)胞的黑素含量低于對照組，說明ISO較高濃度時可促進(jìn)人表皮黑素細(xì)胞的黑素合成，但I(xiàn)SO濃度到達(dá)一定峰值時，對人表皮黑素細(xì)胞的黑素合成就會減弱。

氧化應(yīng)激以線粒體依賴的方式誘導(dǎo)黑素細(xì)胞凋亡。ROS在線粒體內(nèi)累積，引起線粒體膜電位丟失，可激活細(xì)胞色素C的釋放及caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致黑素細(xì)胞凋亡[17]。H2O2介導(dǎo)的氧化應(yīng)激在黑素細(xì)胞丟失中起主要作用從而介導(dǎo)白癜風(fēng)發(fā)生發(fā)展，研究表明，進(jìn)展期白癜風(fēng)患者紅細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中活性氧的生成明顯高于健康對照組[18]，由于高水平的活性氧，白癜風(fēng)患者表皮的抗氧化系統(tǒng)受損。同時，與正常黑素細(xì)胞相比，白癜風(fēng)黑素細(xì)胞表現(xiàn)出高氧化應(yīng)激水平和低抗氧化酶活性，使其對H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激更敏感[19]。在本研究中，ISO可降低H2O2誘導(dǎo)的人表皮黑素細(xì)胞內(nèi)ROS水平，說明ISO可增強黑素細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的能力，從而保護(hù)人表皮黑素細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損害。

總之，本研究表明黑素細(xì)胞活力可隨H2O2濃度增加、處理時間的延長而下降，還發(fā)現(xiàn)了ISO可減輕H2O2對人表皮黑素細(xì)胞活力的影響，在一定濃度時，ISO對人表皮黑素細(xì)胞的黑素合成具有促進(jìn)作用，說明ISO對H2O2引起的正常人表皮黑素細(xì)胞的氧化損傷具有保護(hù)作用。本實驗結(jié)果為抗氧化劑ISO應(yīng)用于白癜風(fēng)的治療提供了一定的實驗基礎(chǔ)，提示了ISO在白癜風(fēng)治療中的潛在價值。