葉麗莎 張德綢 白雪

西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院心腦病科，四川瀘州 646000

冠心病屬于對人們健康產(chǎn)生嚴重威脅的一項疾病，而急性心肌梗死屬于冠心病表現(xiàn)的一種急危重癥。其心肌纖維化成為心室重構(gòu)產(chǎn)生的主要因素，更是預(yù)后效果差預(yù)測的一項關(guān)鍵指標。如何防治心肌纖維化則成為目前研究的熱點。本項目以結(jié)扎左冠狀動脈制備的大鼠（即急性心肌梗死后心室重構(gòu)動物）模型，利用電鏡、免疫組化等方法檢測左心室肥厚指數(shù)、心肌膠原容積分數(shù)（CVF）、Ⅰ型膠原容積分數(shù)（ⅠCVF）、基質(zhì)金屬蛋白酶1（MMP-1）/基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1（TIMP-1），探討心安顆粒對改善急性心肌梗死大鼠心肌梗死后心肌纖維化的可能作用機制［1-9］。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 成年正常雄性SD 大鼠40 只，清潔級，體質(zhì)量160～185 g。由西南醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。

1.2 藥物心安顆粒 由黃芪、苦參、生地、麥冬、板藍根等組成，每克相當于原生藥2.4 g（由西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院提供）?？ㄍ衅绽◤V東彼迪藥業(yè)有限公司）。

1.3 主要試劑與儀器 天狼星紅染色液試劑盒（生產(chǎn)廠家：索萊寶公司）；Trizol核酸提取液（生產(chǎn)廠家：Ambion公司）；MMP-1 抗體、TIMP1 抗體、Ⅰ型膠原蛋白抗體均為RD System 公司產(chǎn)品；光學(xué)顯微鏡（型號BX53，Olympus公司）。

1.4 動物造模 采用左冠狀動脈結(jié)扎的方法，制備急性心肌梗死后心肌重塑模型。

1.5 分組及給藥 將大鼠隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、卡托普利組［20 mg/（kg·d）］、心安顆粒組［心安顆粒9 g/（kg·d）］，每組10 只。按所需劑量灌胃給予，每日1次，直至實驗終點（術(shù)后8周）。

1.6 檢測指標及方法 ⑴給藥療程結(jié)束后，對大鼠腹腔麻醉后取得其心臟組織，迅速放入多聚甲醛中固定，常規(guī)脫水石蠟包埋，切片，取心肌梗死組織塊待檢。⑵CVF 采用天狼星紅染色法對標本進行操作。測算CVF 使用Image-Pro Plus Version 6.0 軟件進行檢測。⑶ⅠCVF、MMP-1、TIMP-1蛋白表達采用免疫組化法檢測。免疫組化法進行檢測時，其陽性表達的標準是：細胞漿顯示棕黃色染色顆粒。針對圖像分析的時候選擇Image-Pro Plus Version 6.0 這一款軟件。⑷左心室肥厚指數(shù)：在給大鼠稱重（BW）以后再處死大鼠，將心臟組織全部取出，依次測定心臟質(zhì)量（HW）及左心室質(zhì)量（LVM），還要計算出大鼠的左心室肥厚指數(shù)，即心臟質(zhì)量指數(shù)（HMI）=HW/BW，左心室質(zhì)量指數(shù)（LVMI）=LVM/BW。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析方法 實驗結(jié)果除形態(tài)學(xué)照片外，實驗數(shù)據(jù)錄入SPSS 19.0，符合正態(tài)分布計量資料采用（±s）表示，執(zhí)行t檢驗與方差分析，并且相關(guān)性分析選擇直線相關(guān)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠CVF、心肌組織Ⅰ型膠原蛋白比較 表1 示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠CVF 升高（P＜0.01）；以模型組為參考，心安顆粒組、卡托普利組大鼠CVF 均下降（均P＜0.01），且卡托普利組低于心安顆粒組（P＜0.01）。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠Ⅰ型膠原蛋白升高（P＜0.01）；與模型組比較，心安顆粒組、卡托普利組大鼠Ⅰ型膠原蛋白均降低（均P＜0.01）；心安顆粒組與卡托普利組Ⅰ型膠原蛋白比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 40只成年正常雄性SD大鼠假手術(shù)組、模型組、卡托普利組、心安顆粒組心肌膠原容積分數(shù)、心肌組織Ⅰ型膠原蛋白比較（± s）

表1 40只成年正常雄性SD大鼠假手術(shù)組、模型組、卡托普利組、心安顆粒組心肌膠原容積分數(shù)、心肌組織Ⅰ型膠原蛋白比較（± s）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01；與卡托普利組對比，cP＜0.01

Ⅰ型膠原蛋白0.05±0.00 0.19±0.00a 0.11±0.00ab 0.12±0.00ab組別假手術(shù)組模型組卡托普利組心安顆粒組數(shù)量10 10 10 10心肌膠原容積分數(shù)（%）5.49±0.97 41.51±0.68a 15.71±0.85ab 23.19±1.47abc

2.2 心肌組織MMP-1、TIMP-1、MMP-1/TIMP-1 與假手術(shù)組比較，模型組MMP-1、TIMP-1、MMP-1/TIMP-1 均增高（均P＜0.05）；與模型組比較，心安顆粒組、卡托普利組MMP-1、TIMP-1、MMP-1/TIMP-1 均減?。ň鵓＜0.01）；心安顆粒組TIMP-1 蛋白表達高于卡托普利組（P＜0.05）。見表2。

表2 40只成年正常雄性SD大鼠假手術(shù)組、模型組、卡托普利組、心安顆粒組MMP-1、TIMP-1、MMP-1/TIMP-1比較（± s）

表2 40只成年正常雄性SD大鼠假手術(shù)組、模型組、卡托普利組、心安顆粒組MMP-1、TIMP-1、MMP-1/TIMP-1比較（± s）

注：MMP-1為基質(zhì)金屬蛋白酶1；TIMP-1為基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1；與假手術(shù)組比較，aP＜0.01，bP＜0.05；與模型組比較，cP＜0.01

組別假手術(shù)組模型組卡托普利組心安顆粒組MMP-1/TIMP-1 0.76±0.05 0.74±0.47b 0.55±0.05c 0.68±0.05c數(shù)量10 10 10 10 MMP-1 0.08±0.05 0.23±0.07a 0.10±0.05c 0.13±0.03c TIMP-1 0.11±0.00 0.31±0.00a 0.18±0.01c 0.19±0.03bc

2.3 每組大鼠左心室肥厚指數(shù)比較與假手術(shù)組比較模型組大鼠HMI、LVMI 顯著增加（均P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠HMI、LVMI 均有不同程度降低。見表3。

表3 40只成年正常雄性SD大鼠假手術(shù)組、模型組、卡托普利組、心安顆粒組HMI、LVMI比較（mg/g，± s）

表3 40只成年正常雄性SD大鼠假手術(shù)組、模型組、卡托普利組、心安顆粒組HMI、LVMI比較（mg/g，± s）

注：HMI 為心臟質(zhì)量指數(shù)，LVMI 為左心室質(zhì)量指數(shù)；與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01

LVMI 2.16±0.13 2.70±0.17a 2.57±0.16b 2.43±0.17b組別假手術(shù)組模型組卡托普利組心安顆粒組數(shù)量10 10 10 10 HMI 2.89±0.16 3.67±0.21a 3.29±0.17b 3.35±0.29b

3 討 論

心安顆粒是由苦參、黃芪、麥冬、赤芍等組成的復(fù)方純中藥制劑。現(xiàn)代藥理研究表明，麥冬能減少心肌耗氧量，增強心肌收縮力，改善心肌缺血狀態(tài)［1-2］。黃芪中的黃芪多糖成分具有調(diào)節(jié)機體免疫力、抗氧化、保護心血管等作用，而黃芪皂苷能清除氧自由基、提高心肌細胞抗缺氧的能力，從而改善心臟功能［3-5］。赤芍可增加冠狀動脈血流量，從而改善心肌缺血缺氧狀態(tài)。前期的相關(guān)工作中，就心安顆粒實施了很系統(tǒng)化與深入化的動物研究，最終結(jié)果顯示：這種制劑能夠顯著改變其心肌炎大鼠的心肌缺血表現(xiàn)，有抗炎、抗氧化以及抗心律失常效果，且調(diào)整免疫等多種辦法，對于心肌有很好的保護作用［6-9］。

急性心肌梗死后心室重構(gòu)被視為心臟功能衰竭的發(fā)病機制之一，同時也是評估患者預(yù)后的重要因素。心肌纖維化是心室重構(gòu)的關(guān)鍵點［10］。研究表明，65 歲以上女性心肌梗死患者5 年后心力衰竭的發(fā)生率為23%［11］，由此可見預(yù)防和逆轉(zhuǎn)心肌纖維化是有效預(yù)防或改善心肌梗死后心力衰竭表現(xiàn)，且改變預(yù)后、生存質(zhì)量的重要方法。細胞外基質(zhì)以及心肌細胞改變均會致使心室重構(gòu)出現(xiàn)。如沉積增多或降解減少，均可直接導(dǎo)致纖維化病變的發(fā)生，并最終導(dǎo)致心室形態(tài)和功能異常。心肌中細胞外基質(zhì)主要由Ⅰ型、Ⅲ型膠原組成，Ⅰ型膠原纖維粗大，伸展性和回彈性較小，抗拉強度高，決定著心肌舒張或收縮實際僵硬程度［3］。這次研究中的模型組Ⅰ型膠原蛋白水平增高，CVF 也表現(xiàn)為增高，膠原沉積增加，極易使得心室形態(tài)以及功能出現(xiàn)異常，以此誘發(fā)心肌重構(gòu)，產(chǎn)生心肌纖維化問題。心安顆粒組、卡托普利組Ⅰ型膠原蛋白對比于模型組為降低，且CVF下降較多，以此保持著心肌膠原代謝處于穩(wěn)定狀態(tài)，對抑制心室重構(gòu)，逆轉(zhuǎn)心肌纖維化起到了關(guān)鍵性的作用。MMP-1 是以心肌間質(zhì)Ⅰ、Ⅲ型膠原為底物的膠原降解酶，對降解細胞外基質(zhì)起著最重要的作用。TIMP-1 是MMP-1 的天然特異性抑制劑，可以與活性MMP-1 不可逆結(jié)合，抑制其對間質(zhì)膠原蛋白的降解。因此，MMP-1/TIMP-1 的比值保持平衡對于維持心肌膠原代謝的穩(wěn)定起著十分重要的作用。MMP-1/TIMP-1 比例失衡是導(dǎo)致心肌重構(gòu)的重要環(huán)節(jié)之一。本次研究結(jié)果所得，心安顆粒能夠控制調(diào)整MMP-1/TIMP-1，調(diào)控細胞外基質(zhì)代謝，從而達到抑制心室重構(gòu)，逆轉(zhuǎn)心肌纖維化的作用。

利益沖突：作者已申明文章無相關(guān)利益沖突。