祝寅 陳蘇杰

1江蘇省句容市人民醫(yī)院血液腫瘤科 212400；2江蘇省句容市人民醫(yī)院CT室 212400

乳腺癌是目前診斷最常見的癌癥，也是女性最致命的疾病之一［1］。乳腺癌的常規(guī)治療包括手術(shù)、放射、化療和糖皮質(zhì)激素治療。然而，并不是所有乳腺癌患者都推薦手術(shù)治療，并且傳統(tǒng)的化療有多種不良反應(yīng)，包括耐藥細胞的出現(xiàn)和毒性反應(yīng)。因此，人們正在研究新的治療方法。光動力療法（photodynamic therapy，PDT）是一種新興的治療方式，早期PDT的研究中，發(fā)現(xiàn)局部乳腺癌是PDT的第一個靶點，隨后PDT 在胸壁轉(zhuǎn)移患者的研究中被證明有效［2-3］。光敏劑5-氨基酮戊酸（5-aminolevulinic acid，5-ALA）已被成功用于診斷和治療腫瘤。與其他類型的光敏劑相比，5-ALA 具有更高的腫瘤特異性和更少的光毒性［4］。PDT 常常與常規(guī)化療相結(jié)合［5］，通過納米技術(shù)形成多模式協(xié)同治療平臺。

本研究針對目前女性高發(fā)、病死率高的的乳腺癌，采用隨機對照實驗以裸鼠乳腺癌移植瘤為模型開展研究，使用5-ALA 聯(lián)合阿霉素（doxorubicin，DOX）進行治療，并對其作用機制進行初步探索，以期為臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 資 料 2020 年10 月，選 取6 周 齡SPF 級 雌 性BALB/c-nu/nu 裸鼠，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司［許可證編號：SCXK（京）2019-0009］，體質(zhì)量（20±2）g。5-ALA 和DOX 購 自 美 國Sigma-Aldrich（純 度 為HPLC≥98.0%），一抗表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducible factor 1α， HIF-1α） 、 3- 磷 酸 甘 油 醛 脫 氫 酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的二抗購自美國Cell Signaling。胎牛血清和RPMI-1640 細胞培養(yǎng)液購自南京生航生物技術(shù)有限公司。4T1 小鼠乳腺癌細胞購自寧波明舟生物科技有限公司。RIPA 裂解緩沖液、BCA 蛋白測定試劑盒、蘇木素伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色試劑盒購自上海碧云天生物。

1.2 方法

1.2.1 乳腺癌小鼠模型的建立 BALB/c-nu/nu 裸鼠飼養(yǎng)在SPF 級實驗動物室的IVC 系統(tǒng)內(nèi)，晝夜循環(huán)飼養(yǎng)12 h，溫度（20±2）℃，相對濕度（60±5）%。動物實驗按照動物研究倫理協(xié)議進行，在誘發(fā)乳腺癌之前，實驗小鼠經(jīng)歷了1 周的新環(huán)境適應(yīng)期。用含10%胎牛血清、鏈霉素（100 U/ml）和青霉素（100 U/ml）的RPMI-1640 培養(yǎng)基在37 ℃的CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4T1 細胞，收集培養(yǎng)的細胞，懸浮于PBS 中，將含2×105個細胞0.2 ml 混合物注射到裸鼠背部皮下。注射后，監(jiān)測小鼠潛在的腫瘤發(fā)展，并使用數(shù)字卡尺測量腫瘤的大小。當(dāng)腫瘤長至約9 mm時，再將其分成4組。

1.2.2 動物分組及治療 將32 只荷瘤裸鼠分為4 組（每組8 只）：A 為空白對照組（不給任何治療）；B 為DOX 組（2 mg/kg DOX，每周1 次，共3 次）；C 為PDT 組（50 mg/kg 5-ALA+660 nm 激光照射，總照射劑量200 J/cm2，同時避光24 h，每周1 次，共3 次）；D 為聯(lián)合治療組（2 mg/kg DOX+50 mg/kg 5-ALA+660nm 激光照射）?；熕幬镒⑸?2 h后，腹腔注射5-ALA，12 h后進行激光照射，能量密度為200 J/cm2，照射時間為20 min。至治療后的第21 天，采用頸椎脫臼法處死裸鼠，腫瘤標(biāo)本取出后先稱瘤重并計算抑瘤率，公式為：（1－治療組平均瘤重）/荷瘤組平均瘤重×100%，將一部分腫瘤組織置于福爾馬林液中固定以備免疫組化染色。在治療過程中，第一次治療前及治療后隔天測量所有裸鼠瘤徑。按照文獻方法 計 算 裸 鼠 瘤 體 積：V（cm3）=d2（cm2）×D（cm）/2［6］，其中d和D依次表示腫瘤的最短和最長徑。

1.3 腫瘤組織形態(tài)學(xué)觀察 腫瘤標(biāo)本在4%多聚甲醛溶液中固定至少24 h 后，石蠟包埋，4 μm 厚切片，脫蠟后HE染色，光鏡下觀察。

1.4 Western blotting 檢測 用RIPA 裂解緩沖液提取腫瘤組織總蛋白，用BCA 檢測試劑盒測定總蛋白濃度。總蛋白（100 μg）經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。經(jīng)5%脫脂牛奶封閉后，將膜與特異性一抗EGFR、HIF-1α 和GAPDH 在4 ℃下孵育過夜。隨后，將樣品與HRP 偶聯(lián)的二抗進行孵育，采用ECL 檢測系統(tǒng)進行灰度值分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 進行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以(±s)表示，采用方差分析，組間兩兩比較方差齊時采用LSD-t檢驗，方差不齊時使用Tamhane's 法，其中P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 5-ALA 聯(lián)合DOX 對乳腺癌荷瘤裸鼠體質(zhì)量的影響 PDT 組 體 質(zhì) 量 為（21.25±1.55）g，空 白 對 照 組 為（20.32±1.34）g、DOX 組為（18.16±1.10）g、聯(lián)合治療組為（17.93±1.21）g，DOX 組、聯(lián)合治療組分別與空白對照組及PDT 組相比，體質(zhì)量均顯著下降（t=2.087、2.986、3.014、4.212，均P＜0.05），而PDT 組與空白對照組、DOX 組與聯(lián)合治療組的體質(zhì)量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.2 5-ALA 聯(lián)合DOX 對乳腺癌荷瘤裸鼠腫瘤體積及抑瘤率的影響 PDT 組腫瘤體積為（0.71±0.13）cm3、DOX 組為（0.65±0.19）cm3、空白對照組為（0.98±0.21）cm3，PDT 組、DOX 組分別與空白對照組比較，腫瘤體積均明顯縮?。╰=5.729、4.388，均P＜0.05）；而聯(lián)合治療組腫瘤體積為（0.41±0.13）cm3，在所有組中最小，與其他組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=10.884、8.769、6.182，均P＜0.05）。聯(lián)合治療組抑瘤率（58.20%，1.10/1.89）顯著高于PDT 組（27.51%，0.52/1.89）和DOX 組（33.86%，0.64/1.89）（t=8.521、8.867，均P＜0.05）。

2.3 5-ALA 聯(lián)合DOX 對乳腺癌荷瘤裸鼠病理結(jié)果的影響 HE 染色顯示空白對照組腫瘤細胞致密，結(jié)構(gòu)完整。其余各組細胞凋亡和壞死明顯增多，凋亡細胞縮小，胞漿濃縮，其中聯(lián)合治療組細胞凋亡和壞死最嚴(yán)重。

2.4 5-ALA 聯(lián)合DOX 對乳腺癌荷瘤裸鼠EGFR 和HIF-1α 蛋白表達的影響 研究結(jié)果表明，PDT 組和聯(lián)合治療組與空白對照組和DOX 組相比，EGFR 和HIF-1α 蛋白表達均顯著下降（t=2.354、3.287、4.239、5.894，均P＜0.05）。見圖1。

圖1 5-ALA聯(lián)合DOX對乳腺癌荷瘤裸鼠EGFR（A）和HIF-1α（B）蛋白表達的影響

3 討 論

現(xiàn)有的乳腺癌臨床治療方法不良反應(yīng)大、預(yù)后差，迫切需要新的有效治療乳腺癌的方法。PDT 是一種很有前途的微創(chuàng)治療方法，自20世紀(jì)90年代以來被廣泛應(yīng)用于各種腫瘤的治療［7］。PDT 與傳統(tǒng)放療或化療的優(yōu)勢變得越來越明顯，包括部位特異性、克服腫瘤對其他療法的耐藥性及不良反應(yīng)很少。本研究結(jié)果也顯示，PDT 組與空白對照組相比，體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，雖然聯(lián)合治療組與空白對照組、PDT相比，體質(zhì)量均顯著下降，但其與DOX組之間的體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明了PDT 治療具有不良反應(yīng)小的優(yōu)點。

PDT 的治療優(yōu)勢在于它能夠靶向乳腺腫瘤，并將對其他正常組織的損害降至最低，它還與化療有協(xié)同抗癌作用。本研究顯示聯(lián)合治療組小鼠的腫瘤體積最小、抑瘤率最高，且病理結(jié)果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療組與其他組相比，細胞凋亡和壞死最嚴(yán)重，表明PDT聯(lián)合化療治療乳腺癌具有較好的療效，兩者聯(lián)用具有協(xié)同增效的作用。

EGFR是一種酪氨酸激酶受體，在許多類型的實體腫瘤中被認(rèn)為是癌基因，30%的乳腺癌過度表達EGFR，這種過度表達與不良預(yù)后相關(guān)［8］。而缺氧或低氧濃度是導(dǎo)致腫瘤進展的另一個因素，HIF-1α 激活血管生成［9］，并抑制凋亡［10］。因此，缺氧腫瘤往往與不良的預(yù)后相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)PDT可以抑制腫瘤組織EGFR和HIF-1α蛋白的表達。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)PDT 聯(lián)合DOX 治療乳腺癌具有療效好、不良反應(yīng)小的優(yōu)點，機制可能與PDT 抑制EGFR 和HIF-1α蛋白表達有關(guān)。

利益沖突：作者已申明文章無相關(guān)利益沖突。