崔 凱，支亞男，王壯壯，公孫鑫，白峻峰

(西安國(guó)際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院胸腔外科，陜西 西安 710100)

非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)是呼吸系統(tǒng)常見腫瘤[1]。因高發(fā)病率和致死率，NSCLC在世界范圍內(nèi)成為研究熱點(diǎn)[2-3]。腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力對(duì)腫瘤在體內(nèi)的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移具有非常重要的意義[4]。研究[5]顯示NSCLC中肺癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和形成新病灶的能力，但是轉(zhuǎn)移機(jī)制尚不清楚。微小RNA(miR)是近些年在腫瘤中研究發(fā)現(xiàn)的一類具有重要生物調(diào)節(jié)功能的小分子RNA，其對(duì)腫瘤異常增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力都具有直接或者間接的調(diào)控作用[6]。研究[7-8]發(fā)現(xiàn)，miR-30在多種惡性腫瘤(如胃癌、結(jié)腸癌、肝癌等)中發(fā)揮促癌作用，但是其在NSCLC中作用如何，是否同樣發(fā)揮促癌作用，目前鮮有報(bào)道。因此，本研究觀察miR-30對(duì)NSCLC侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響，并分析其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 病理標(biāo)本 收集本院收治的30例NSCLC患者的癌組織和癌旁組織，所有患者均經(jīng)病理確診，患者及其家屬對(duì)本研究知情同意。

1.2 主要試劑 人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞和正常肺支氣管上皮細(xì)胞系HBE細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；DMEM(No.102432)、胎牛血清(No.542354)、胰酶(No.643421)和青鏈霉素混合液(No.175423)購(gòu)自Gibco公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen公司；Transwell小室購(gòu)自Corning公司；白細(xì)胞介素-6(IL-6，No.1035332)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3(STST3，No.7654543)、p-STAT3(No.2453245)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(No.7865453)購(gòu)自Abcam公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(No.2457)購(gòu)自上海碧云天公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞隨機(jī)分配到不同組，用小干擾RNA(siRNA)和相應(yīng)的陰性對(duì)照(siNC)轉(zhuǎn)染它們。每組包含3×105個(gè)細(xì)胞，用Lipofectamin 2000進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染前24 h將細(xì)胞接種在6孔板中，融合30%～40%。每次轉(zhuǎn)染使用siRNA和siNC各20 nmol/L。

1.4 實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)檢測(cè)RNA表達(dá) 將臨床肺癌及癌旁組織樣本勻漿后和細(xì)胞樣本分別加入1 ml TRIzol裂解液提取總RNA，隨后采用Takara公司5×Prime Script RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得總cDNA，基因相對(duì)表達(dá)量根據(jù)2-ΔΔCT法進(jìn)行計(jì)算。qRT-PCR引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.5 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-30 mimic和miR-30 inhibitor，8 h后換完全DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。細(xì)胞密度1×104接種至96孔板，分別于接種后1～5 d每孔加入10 μl CCK-8溶液，37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)孵育1～4 h。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在450 nm處讀取吸光值(OD)并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.6 Transwell遷移與侵襲實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞基質(zhì)膠用預(yù)冷的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基以1∶9稀釋，每孔加40 μl，37 ℃孵育5 h后水化基底膜。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-30 mimic和miR-30 inhibitor， 8 h后換完全DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。采用0.25%胰蛋白酶消化、中和，離心并重懸細(xì)胞于無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，每孔接種5×104個(gè)細(xì)胞于24孔培養(yǎng)板內(nèi)的Transwell小室上室中，下室加入600 μl含10% 胎牛血清的完全DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2條件下于孵箱中培養(yǎng)，每種細(xì)胞設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞遷移14 h和侵襲20 h后取出培養(yǎng)板并棄上清，PBS清洗后分別加入600 μl 4%多聚甲醛和0.1%結(jié)晶紫染液于室溫下固定和染色15 min，PBS清洗后用棉簽輕輕擦去Transwell小室上室中未遷移和侵襲細(xì)胞。倒置相差顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野觀察被染成紫色的穿過膜的細(xì)胞，拍照記錄細(xì)胞遷移和侵襲情況。

1.7 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-30 mimic和miR-30 inhibitor， 8 h后換完全DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。采用0.25%胰蛋白酶消化、中和，離心并重懸細(xì)胞后加入100 μl PIPA裂解液和0.15 μl PMSF裂解液于室溫下裂解細(xì)胞5 min，4 ℃離心15 min，吸取上清，進(jìn)行SDS-PAGE蛋白凝膠電泳和轉(zhuǎn)膜，一抗IL-6、STAT3和p-STAT3避光孵育，4 ℃冰箱過夜。次日孵育二抗，ECL發(fā)光儀檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 miR-30在癌組織與癌旁組織、A549細(xì)胞與HBE細(xì)胞中的表達(dá)比較 見圖1。miR-30在癌組織中表達(dá)顯著高于癌旁組織，在A549細(xì)胞中表達(dá)顯著高于HBE細(xì)胞(均P<0.05)。

注：圖A中，與癌旁組織比較，*P<0.05，**P<0.01；圖B中，與HBE細(xì)胞比較，**P<0.01

2.2 miR-30 mimic和miR-30 inhibitor轉(zhuǎn)染后miR-30表達(dá)變化 見圖2。qRT-PCR結(jié)果顯示，A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-30 mimic后miR-30表達(dá)上調(diào)4.142倍，miR-30 inhibitor轉(zhuǎn)染后miR-30表達(dá)降低76%(均P<0.05)。

注：與Control組比較，**P<0.01

2.3 miR-30對(duì)A549細(xì)胞遷移能力的影響 見圖3。

Transwell結(jié)果顯示，miR-30 mimic轉(zhuǎn)染后穿膜細(xì)胞數(shù)顯著多于對(duì)照組，而miR-30 inhibitor轉(zhuǎn)染后穿膜細(xì)胞數(shù)顯著少于對(duì)照組(均P<0.05)。

2.4 miR-30對(duì)A549細(xì)胞侵襲能力的影響 見圖4。Transwell結(jié)果顯示，miR-30 mimic轉(zhuǎn)染后細(xì)胞侵襲能力顯著強(qiáng)于對(duì)照組，而miR-30 inhibitor轉(zhuǎn)染后細(xì)胞侵襲能力顯著弱于對(duì)照組(均P<0.05)。

2.5 miR-30對(duì)IL-6和STAT3 mRNA表達(dá)的影響 見圖5。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-30 mimic轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞中IL-6和STAT3的mRNA表達(dá)顯著增加，miR-30 inhibitor轉(zhuǎn)染后IL-6和STAT3的mRNA表達(dá)隨之降低(均P<0.05)。

注：與Control組比較，**P<0.01

注：與Control組比較，**P<0.01

2.6 miR-30對(duì)IL-6和STAT3蛋白表達(dá)的影響 見圖6。Western blot結(jié)果表明，miR-30 mimic轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞中IL-6和STAT3蛋白表達(dá)顯著增加，而miR-30 inhibitor轉(zhuǎn)染后IL-6和STAT3蛋白表達(dá)隨之降低(均P<0.05)。

注：與Control組比較，**P<0.01

3 討 論

肺癌是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的主要癌癥之一，多數(shù)肺癌患者即使經(jīng)過手術(shù)及放化療等聯(lián)合治療，術(shù)后總體5年生存率仍低于20%[9]。肺癌患者中NSCLC約占80%[10]。目前針對(duì)NSCLC的治療雖然已經(jīng)取得一定的進(jìn)展，但是NSCLC具有較高的侵襲和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移能力，可在患者體內(nèi)形成新的病灶，導(dǎo)致患者術(shù)后恢復(fù)較差且生存率低[11-13]。因此，探究NSCLC發(fā)生、發(fā)展的原因并進(jìn)一步揭示其高侵襲和轉(zhuǎn)移能力的分子機(jī)制具有重要臨床意義。

miR-30是一種具有多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)因子[14]。研究[15]發(fā)現(xiàn)miR-30參與了人體多種生物學(xué)過程。例如，miR-30促進(jìn)惡性膠質(zhì)瘤患者內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)的大量增殖和遷移，且這種增殖和遷移在患者臨床進(jìn)程中隨著腫瘤惡化程度達(dá)到高峰，隨后是一段較長(zhǎng)的分化、存活和整合期[16]。此外，miR-30過表達(dá)抑制導(dǎo)致NSC增殖率下降的機(jī)制及其伴隨的代謝變化取得一定進(jìn)展[17]。最近的研究[18]表明，miR-30異常表達(dá)能夠介導(dǎo)缺血缺氧后胃癌和膀胱癌的發(fā)生與發(fā)展。同時(shí)，研究證實(shí)miR-30過表達(dá)通過介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的有氧糖酵解進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌的惡性發(fā)展。

注：與Control組比較，**P<0.01

IL-6/STAT3信號(hào)通路被證實(shí)與多種腫瘤的異常激活密切相關(guān)，其與腫瘤微環(huán)境中的多種炎癥因子相關(guān)，并且激活腫瘤微環(huán)境中炎癥因子的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤的異常增殖和侵襲等惡性生物學(xué)行為。IL-6作為一種促炎因子，在多種腫瘤中呈異常高表達(dá)，現(xiàn)有研究證實(shí)其不僅可以促進(jìn)炎性因子的表達(dá)，同時(shí)會(huì)導(dǎo)致腫瘤相關(guān)mRNA的異常表達(dá)，在結(jié)腸癌中IL-6促進(jìn)miR-31的分泌從而激活結(jié)腸癌細(xì)胞的異常增殖。同時(shí)，IL-6可以激活STAT3的磷酸化，激活STAT3信號(hào)通路，從而抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。STAT3激活不僅會(huì)使基因轉(zhuǎn)錄失調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞增殖、血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移，而且還影響調(diào)控細(xì)胞凋亡的小分子RNA的表達(dá)變化[19]。但是目前在NSCLC中關(guān)于miR-30與IL-6/STAT3信號(hào)通路相互關(guān)系的研究較少。

本研究通過比較30例臨床不同病理分期NSCLC患者的癌組織與癌旁組織、人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞與正常肺支氣管上皮細(xì)胞系HBE中miR-30的表達(dá)，分析miR-30對(duì)IL-6/STAT3信號(hào)通路活性的影響，揭示NSCLC發(fā)生與發(fā)展的新機(jī)制。結(jié)果表明，miR-30在NSCLC患者癌組織和A549細(xì)胞中的表達(dá)較癌旁組織和HBE細(xì)胞明顯升高。miR-30 mimic轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞中IL-6/STAT3信號(hào)通路顯著激活，同時(shí)明顯增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲和遷移能力，而miR-30 inhibitor轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞中IL-6、STAT3 mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯降低，同時(shí)細(xì)胞的侵襲和遷移能力明顯受到抑制，表明miR-30的異常表達(dá)與NSCLC的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。

綜上所述，miR-30能促進(jìn)NSCLC侵襲和轉(zhuǎn)移能力，其機(jī)制可能與激活I(lǐng)L-6/STAT3信號(hào)通路有關(guān)。因此，靶向miR-30有望成為臨床抗NSCLC轉(zhuǎn)移治療的新路徑，同時(shí)可考慮將血清miRN-30作為NSCLC患者早期診斷及預(yù)后指標(biāo)。