陳小艷，惠 坤，馬科黨

(1.延安大學咸陽醫(yī)院皮膚科，陜西 咸陽 712000；2.陜西省中醫(yī)醫(yī)院皮膚科，陜西 西安 710003)

白癜風是臨床常見的一種自身免疫性疾病，其發(fā)病機制尚不明確，極難治愈，發(fā)病率較高，損壞患者容貌，對患者的自尊心造成極大的傷害，嚴重影響患者的生活質量[1-3]。目前研究顯示[4-5]，白癜風發(fā)病的兩個重要因素包括免疫反應和氧化應激反應，其中氧化應激損傷可引發(fā)黑素細胞損傷，已受到臨床的廣泛關注。抗氧化活性是表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin gallate，EGCG)的一項重要功能，同時EGCG可保護肝臟、抗突變、抗癌的作用，且可避免抗氧化活性傷害腎細胞[6]。但EGCG脂溶性較差，生物利用度低，難以被皮膚吸收，對藥物藥效的發(fā)揮造成影響?？Х人嵫苌颳SY6是一種新的衍生物，李成檀等[7]通過的研究提示，咖啡酸及其衍生物是一類重要的多酚化合物，分布廣泛，具有顯著的調節(jié)免疫、抗氧化、抗炎癥等作用。但目前臨床關于咖啡酸衍生物WSY6是否具有抗氧化作用的相關報道較少。因此，本研究將探討咖啡酸衍生物WSY6對H2O2誘導的黑素細胞氧化損傷的保護作用及潛在分子機制研究，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 我院泌尿外科健康人環(huán)切包皮人表皮黑素細胞，取材時已經(jīng)本人同意且簽訂知情同意書。美國Sigma公司生產(chǎn)的異丁基甲基黃嘌呤(IBMX)、二甲基亞砜(DMSO)、霍亂毒素；美國 Promega 公司生產(chǎn)的乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒、單溶液細胞增殖檢測(MTS)試劑盒；美國Gibco公司生產(chǎn)的胎牛血清、鏈霉素、青霉素及F12培養(yǎng)基；上海碧云天生物技術有限公司生產(chǎn)的Western印跡上樣緩沖液、活性氧(ROS)檢測試劑盒；美國CST 公司生產(chǎn)的c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)、細胞外調節(jié)蛋白激酶(ERK)、磷酸化p38、caspase-9、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3(caspase-3)、細胞色素 C(Cyto-C)、抗β肌動蛋白、p53(p-p53、p-ERK、p-p38、p-JNK)抗體等Western印跡實驗所用抗體；美國 LI-COR公司生產(chǎn)的Odyssey 雙色紅外熒光成像系統(tǒng)；浙江大學藥學院合成WSY6(純度>95%)；美國MD公司生產(chǎn)的Spectra Max酶標儀；美國 BD 公司生產(chǎn)的Facsealibur 流式細胞儀。

1.2 人表皮黑素細胞培養(yǎng)及細胞毒性實驗 將包皮壁沿虹膜剪下，設置溫度為37 ℃，采用0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)及0.25%胰酶將剪下的包皮壁消化10 min；刮下的真皮上及角質層下的細胞采用立體顯微鏡下觀察，以離心率為1000 r/min離心5 min，將沉淀細胞收集并置入HU16培養(yǎng)基中培養(yǎng)，設置溫度為37 ℃，5%CO2培養(yǎng)后，接種至每孔1×104個細胞的96孔板，加入100 μl HU16培養(yǎng)液。培養(yǎng)12 h，細胞貼壁后將培養(yǎng)液吸棄，將 WSY6培養(yǎng)基(100、50、25、12.5、6.24、3.12、1.56、0.39、0 μmol/L)加入，培養(yǎng)1 d，將MTS 試劑加入，設置溫度為37 ℃培養(yǎng)60 min，A490值采用酶標儀檢測。每組設置3個復孔，上述實驗連續(xù)3次。細胞存活率=[研究組(不同濃度WSY6組)A490值-空白組A490值]/(H2O2組A490值-空白組A490值)×100%。

1.3 細胞存活率測定 將對數(shù)生長期的黑素細胞(每孔1×104個)接種于96孔板中，將其設置為25、12.5、6.25 μmol/L WSY6組、H2O2組及空白組，分別將25、12.5、6.25 μmol/L WSY6預處理1 h，清洗后(Hu16培養(yǎng)基)，將1 mmol/L H2O2分別加入WSY6組和H2O2組培養(yǎng)1 h，清洗3次(Hu16培養(yǎng)基)，將培養(yǎng)基分別加入WSY6組、H2O2組及空白組，培養(yǎng)24 h。加入MTS，37 ℃孵育1 h，A490值采用酶標儀測定。每組復孔3個。計算細胞存活率。

1.4 黑素細胞LDH水平測定 將對數(shù)生長期的黑素細胞(每孔1×104個)接種于96孔板中，將其設置為25、12.5、6.25 μmol/L WSY6組、H2O2組及空白組，分別將25、12.5、6.25 μmol/L WSY6預處理1 h，清洗后(Hu16培養(yǎng)基)，培養(yǎng)1 d，對各組細胞培養(yǎng)上清液中LDH含量采用LDH試劑盒說明書測定，黑素細胞裂解液不做處理的LDH含量為100。將部分黑素細胞分為H2O2組和抑制劑組：先采用美國Selleck公司生產(chǎn)的SB203580 p38抑制劑對抑制組預處理1 h后，將1 mmol/L H2O2分別加入抑制劑組和H2O2組，清洗3次后(Hu16培養(yǎng)基)繼續(xù)培養(yǎng)1 d，各組LDH釋放量采用LDH試劑盒說明書測定，LDH釋放量=[研究組(不同濃度WSY6組)上清液A490-空白上清液A490]/(抑制劑組A490-H2O2組A490)×100%。

1.5 黑素細胞ROS水平測定 在以3×105個為每孔細胞數(shù)6孔板內(nèi)接種黑素細胞，細胞貼壁后，將黑素細胞分為WSY6 組、空白組、H2O2組，分別將25、12.5、6.25 μmol/L WSY6預處理1 h，清洗后(Hu16培養(yǎng)基)，其中WSY6組采用25 μmol/L WSY6預處理1、2、4 h，H2O2組和WSY6組細胞再用1 mmol/L H2O2處理1 h，采用培養(yǎng)基清洗，將1 ml 10 mmol/L 2，7-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCF-DA)，設置溫度為37 ℃，在黑暗中培養(yǎng)30 min,將PBS懸浮細胞加入，胞內(nèi)ROS水平采用流式細胞儀測定。該實驗需連續(xù)3次。

1.6 黑素細胞caspase-3、Cyto-C及caspase-9等蛋白水平采用Western印跡法測定 在每孔細胞數(shù)量為3×105個6孔板內(nèi)接種黑素細胞，將對數(shù)生長期的黑素細胞(每孔1×104個)接種于96孔板中，將其設置為25、12.5、6.25 μmol/L WSY6組、H2O2組及空白組，分別將25、12.5、6.25 μmol/L WSY6預處理1 h，清洗后(Hu16培養(yǎng)基)，完成后，收集裂解細胞，提取裂解細胞蛋白，電泳，轉入蛋白，5%脫脂奶粉，室溫封閉1 h，將一抗(兔抗人Cyto-C、p-ERK、p-p38、caspase-9、p-p53、caspase-3抗體、p-NK抗體及鼠抗人β肌動蛋白)，設置溫度為4 ℃孵育12 h，洗膜后，將山羊抗兔IgG抗體加入，孵育1 h后，掃描分析。以上實驗為確保準確性均需連續(xù)3次。

2 結 果

2.1 0.39～50 μmol/L WSY6對黑素細胞存活率的影響 1 d后，0.39～50 μmol/L WSY6組細胞存活率與空白組比較，差異沒有統(tǒng)計學意義(F=1.892，P>0.05)；加入100 μmol/L WSY6后細胞存活率與空白組比較顯著降低(t=15.588，P=0.004)，見表1。

表1 0.39～50 μmol/L WSY6對黑素細胞存活率的影響

2.2 不同濃度WSY6對氧化應激下黑素細胞活性的影響 WSY6組細胞明顯優(yōu)于H2O2組(圖1)。H2O2組細胞存活性明顯低于空白組，而0.39～50 μmol/L WSY6預處理后，細胞存活率明顯高于H2O2組，且濃度越高細胞存活率越高，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，見表2。

表2 不同濃度WSY6對黑素細胞存活率的影響

A：空白組，黑素細胞呈樹枝狀，樹枝連成網(wǎng)狀；B:H2O2組，細胞貼壁數(shù)量減少，樹突狀消失；C:12.5 μmol/L WSY6組，貼壁細胞增多，樹突無改變；D:為25 μmol/L WSY6組，增多的貼壁細胞，細胞狀態(tài)良好

2.3 不同濃度WSY6對黑素細胞LDH釋放量的影響 6.25～25 μmol/L WSY6細胞LDH釋放量均較空白組顯著升高，而較H2O2組均顯著降低(P<0.05)，且WSY6濃度越低則降低越明顯(r=-0.949，P<0.01)。p38抑制劑組和H2O2組黑素細胞LDH釋放量比較差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 不同濃度WSY6對黑素細胞LDH釋放量的影響

2.4 黑素細胞ROS水平受WSY6的影響 將空白組細胞內(nèi)ROS水平設定為1，對25 μmol/L WSY6預處理1、2和4 h后，細胞內(nèi)ROS水平分別為7.61±0.87、6.32±0.32、5.21±0.32，H2O2組黑素細胞內(nèi)ROS水平上升至18.42±1.63，不同時間處理25 μmol/L WSY6與H2O2組比較均顯著降低(P<0.05)。黑素細胞內(nèi)ROS含量隨WSY6預處理時間越長而越低(r=-0.892，P<0.05)。

2.5 黑素細胞凋亡相關蛋白表達受WSY6的影響 黑素細胞僅少量表達caspase-3、Cyto-C及caspase-9采用H2O2處理，caspase-3、Cyto-C及caspase-9表達含量均明顯升高，但經(jīng)WSY6分別對caspase-3、Cyto-C及caspase-9處理后，caspase-3、Cyto-C及caspase-9表達均降低(圖2)。p-p38、p-ERK和p-JNK均采用H2O2對處理后，其表達水平均高于空白組(圖3)；對WSY6預處理后，H2O2WSY6濃度明顯低于p-p38的表達，H2O2WSY6濃度越低則H2O2WSY6表達越低，而p-JNK、p-ERK的表達無改變；而WSY6濃度升高后p38 MAPK下游產(chǎn)物p-p53的表達則降低。聯(lián)合WSY6或單獨H2O2處理JNK、ERK及p38總蛋白水平均無明顯變化。

1：空白組；2：H2O2組；3～5：16.25、12.5、25μmol/L WSY6組

圖3 p-p38、p-ERK和p-JNK均采用H2O2對處理后表達變化情況

3 討 論

白癜風是一種常見的由表皮黑素細胞破壞造成的色素脫失性疾病。該病發(fā)病機制尚不清除，但與氧化應激、神經(jīng)精神、免疫、遺傳、功能性黑素細胞凋亡和丟失等相關。目前氧化應激學說已成為臨床研究的熱點及重點。趙曉菲等[8]通過的研究證實，氧化應激機制在白癜風中發(fā)揮重要作用，且與病情活動程度相關?？Х人嵫苌锸遣枞~、咖啡、水果、蔬菜等植物中存在的常見形式，屬于中性酚類化合物，已有相關研究證實[9-11]，經(jīng)合成的咖啡酸酰胺可作為有效的抗氧化劑，而咖啡酸衍生物WSY6是一種新的衍生物，不僅具有較強的抗氧化作用，而且具有較強的抗菌活性。但咖啡酸衍生物WSY6是否對H2O2誘導的黑素細胞氧化損傷具有保護作用及其機制的相關研究較少[12-14]?；诖耍狙芯刻接懣Х人嵫苌颳SY6對H2O2誘導的黑素細胞氧化損傷的保護作用及潛在分子機制研究，以提高治療效果，改善患者生活質量，為白癜風患者的治療提供新思路，對臨床白癜風患者的治療具有重要意義及價值。

本研究結果顯示，采用100 μmol/L WSY6后，細胞存活率為(91.0±1.0)%，與空白組比較(P<0.05)，提示咖啡酸衍生物WSY6濃度越高，細胞存活率越高，細胞存活率與咖啡酸衍生物WSY6濃度密切相關。在白癜風活動期皮損中過氧化氫酶水平降低，H2O2濃度可達到毫摩爾濃度，在黑素細胞自毀學說中氧化應激被認為是導致白癜風患者表皮黑素細胞消失的始動因素[15-17]。因此，本研究設置H2O2組，以觀察咖啡酸衍生物WSY6對黑素細胞的影響情況。本研究結果顯示，WSY6組細胞明顯優(yōu)于H2O2組，保護效果隨濃度升高而越好；H2O2組細胞存活性明顯低于空白組，而不同濃度WSY6預處理后，細胞存活率明顯高于H2O2組，且濃度越高細胞存活率越高(P<0.05)，提示咖啡酸衍生物WSY6細胞存活率明顯優(yōu)于H2O2，且濃度越高，存活率越高。另外本研究對不同濃度WSY6對黑素細胞LDH釋放量的影響進行研究，結果顯示，H2O2處理后， 0.39～50 μmol/L WSY6細胞LDH釋放量均高于空白組(P<0.05)； 0.39～50 μmol/L WSY6預處理1 h后，不同濃度組LDH釋放量均低于H2O2組(P<0.05)，且WSY6濃度越低則降低越明顯(P<0.01)，提示咖啡酸衍生物WSY6抗黑素細胞氧化作用較好，對細胞內(nèi)LDH釋放量具有明顯的降低作用。

Schallreute等[18]通過的研究提示，白癜風患者皮損部位存在H2O2，且可導致H2O2積累，其暴露會誘發(fā)黑素細胞胞內(nèi)ROS水平增加，增加潛在的細胞毒性，損傷細胞或導致細胞凋亡。故治療白癜風的一種有效手段是采用抗氧化劑去除ROS。本研究結果顯示，不同時間處理25 μmol/L WSY6與H2O2組比較(均P<0.05)；對WSY6預處理時間越長，黑素細胞內(nèi)ROS含量則越低(均P<0.05)，提示采用H2O2處理黑素細胞后，細胞內(nèi)ROS水平增加，給予WSY6預處理后，可明顯降低黑素細胞內(nèi)ROS水平，且隨著處理時間的延長，黑素細胞內(nèi)ROS含量則越低。

Mastore等[19]通過的研究提示，JNK、ERK1/2、p38 MAPK等MAPK家族成員在細胞黑素生成中發(fā)揮重要作用。Giovannelli等[20]通過的研究則提示，ROS堆積異常會刺激MAPK旁路，進而影響基因表達，造成炎癥反應和細胞凋亡。本研究結果顯示，黑素細胞僅少量表達caspase-3、Cyto-C及caspase-9，采用H2O2處理，caspase-3、Cyto-C及caspase-9表達含量均明顯升高，但經(jīng)WSY6分別對caspase-3、Cyto-C及caspase-9處理后，caspase-3、Cyto-C及caspase-9表達均降低；p-p38、p-ERK和p-JNK均采用H2O2處理后，其表達水平均高于空白組；對WSY6預處理后，H2O2WSY6濃度明顯低于p-p38的表達，H2O2WSY6濃度越低則H2O2WSY6表達越低，而p-JNK、p-ERK的表達無改變；而WSY6濃度升高后p38 MAPK下游產(chǎn)物p-p53的表達則降低，提示H2O2對黑素細胞JNK、ERK及p38 MAPK具有刺激作用，但WSY6預處理具有抑制H2O2介導的p38磷酸化。故在H2O2介導的黑素細胞凋亡中激活p38 MAPK可起到重要作用，而WSY6對黑素細胞的保護作用主要通過抑制p38 MAPK的活性發(fā)揮。

綜上所述，WSY6減弱H2O2介導的黑素細胞氧化應激損傷和凋亡，主要通過下調細胞ROS水平，對Cyto-C表達和p38 MAPK活性具有抑制作用，提示W(wǎng)SY6可為白癜風的治療提供新思路。