鄭惠中，楊開朗，覃艷妮，郭文娟，溫俊寶

(北京林業(yè)大學(xué)林木有害生物防治北京市重點實驗室，北京 100083)

臭椿溝眶象Eucryptorrhynchusbrandti(Harold)屬鞘翅目Coleoptera象甲科Curculionidae溝眶象屬Eucryptorrhynchus，是危害臭椿Ailanthusaltissima(Mill.)Swingle及其變種千頭椿的主要鉆蛀性害蟲(趙養(yǎng)昌, 1980; Borovec, 2013)，常與其近緣種溝眶象E.scrobiculatus(Motschulsky)混合危害，近年來在寧夏發(fā)生尤其嚴(yán)重，已成為危害寧夏林業(yè)的主要害蟲。臭椿溝眶象幼蟲孵化后蛀入韌皮部，隨著蟲體發(fā)育向內(nèi)鉆蛀取食，形成不規(guī)則坑道，嚴(yán)重破壞臭椿樹的輸導(dǎo)組織(葛騰, 2000)。臭椿受臭椿溝眶象和溝眶象的單獨或混合危害，造成大量死亡或樹勢衰弱。

近年來生產(chǎn)上利用昆蟲捕獲網(wǎng)對溝眶象的阻隔及捕獲效果顯著(Yangetal., 2018; Yangetal., 2019)，但因溝眶象和臭椿溝眶象的體型區(qū)別，臭椿溝眶象蟲體小肩部窄，行動更靈便，易穿過裙擺式捕蟲網(wǎng)的洞口，因此無法用捕蟲網(wǎng)有效防控臭椿溝眶象。目前對臭椿溝眶象等鉆蛀性害蟲仍以化學(xué)防治為主。王旭(2019)對臭椿溝眶象幼蟲的殺蟲劑室內(nèi)毒力測定結(jié)果顯示氯氰菊酯>吡蟲啉>啶蟲脒；楊鵬(2015)通過樹干注藥測試殺蟲劑對溝眶象的防治效果，其中5%吡蟲啉對溝眶象的致死率為38.79%，為效果較優(yōu)的藥劑；楊開朗(2015)在兩種象甲危害初期，在樹干捆綁塑料裙基礎(chǔ)上使用氯氰菊酯常規(guī)噴霧，在危害初期防治效果較好。由于臭椿溝眶象幼蟲在樹干內(nèi)隱蔽活動、越冬，林間注藥、噴霧得使用高藥量、頻用藥才可以起到防治效果，對環(huán)境危害大、農(nóng)田土壤污染重，且害蟲易產(chǎn)生抗藥性。為降低農(nóng)藥使用量，本研究尋找新的針對臭椿溝眶象幼蟲高效、環(huán)境友好的防治技術(shù)(楊忠岐等, 2018)。

昆蟲病原線蟲(Entomopathogenic nematodes, EPN)能主動搜尋寄主昆蟲、專性寄生，適應(yīng)臭椿溝眶象幼蟲的鉆蛀特性。EPN對人畜、植物及有益生物安全，在大多數(shù)歐美國家和政府可以豁免注冊、生產(chǎn)及施放(叢斌等, 1999; 董國偉等, 2001)。全球已有多種昆蟲病原線蟲商品化生產(chǎn)并田間大面積應(yīng)用。我國有使用斯氏線蟲防治臭椿溝眶象、溝眶象的初步探索(佟振亮等, 1993; 秦緒兵等, 1999)，對象甲類害蟲進行生物防治時常選用斯氏線蟲。如SteinernemacarpocapsaeA24對香蕉扁黑象甲幼蟲和成蟲都有較高的毒力(徐潔蓮, 1991)；Dembilio等(2009)利用斯氏線蟲S.carpocapsae在田間控制紅棕象甲Rhynchophorusferrugineus的防治效果為83.8%～99.7%；Shamseldean等(2004)分別從3個不同的區(qū)域收集了3種有效的Steinernema線蟲，經(jīng)過室內(nèi)實驗對紅棕象甲的致死率均能達(dá)到100%；Llácer等(2009)使用手動背負(fù)式噴霧器對棕櫚樹干和基部進行噴灑，對紅棕象甲的防治效果可達(dá)到80%和98%。因此本試驗選用了對臭椿溝眶象幼蟲防效較好的兩個商品化斯氏線蟲品系。

將昆蟲病原線蟲與其他殺蟲制劑結(jié)合使用，是對許多害蟲常規(guī)化學(xué)防治的有效替代。與普通化學(xué)殺蟲劑相比，EPN的使用成本仍然過高，將EPN與殺蟲劑聯(lián)合使用，可有效抑制害蟲危害(Koppenhofer and Grewal, 2005)，減緩抗藥性的發(fā)展，也可以降低EPN的施用量從而降低防治成本(Yanetal., 2012)。EPN和蘇云金芽孢桿菌Bacillusthuringiensis、白僵菌Beauveriabassiana(Balsamo)Vuillemin、吡蟲啉等混用比各自單獨使用會產(chǎn)生協(xié)同作用(Koppenh?feretal., 1997; Koppenh?feretal., 1998; Koppenh?feretal., 2000; Polararevpnetal., 2007; Koppenh?feretal., 2008)。王果紅等(2007)利用小卷蛾斯氏線蟲All品系與毒死蜱、吡蟲啉混用防治褐紋甘蔗象Rhabdosceluslineaticollis(Heller)，防效明顯優(yōu)于單獨使用化學(xué)藥劑毒死蜱、吡蟲啉或小卷蛾斯氏線蟲。王玉東等(2012)將低濃度的吡蟲啉與S.longicaudumX-7線蟲混用后處理暗黑金龜Holotrichiaparallela2齡幼蟲，殺蟲效果明顯提高。Williams等(2013)將S.carpocapsaeWeiser線蟲、白僵菌、綠僵菌配置懸浮液混合在樹樁周圍施用，防治蛀干害蟲松樹皮象Hylobiusabietis，對松樹皮象的致死率可達(dá)60%等。

本文測定了3種化學(xué)殺蟲劑與不同品系商品化斯氏線蟲混合使用的效果，通過確定高效應(yīng)用組合，為臭椿溝眶象幼蟲的綜合治理和未來昆蟲病原線蟲的田間應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試?yán)ハx及線蟲

供試?yán)ハx：臭椿溝眶象3齡幼蟲，采自寧夏石嘴山市平羅縣小興墩、大興墩、通伏鄉(xiāng)等地，由室內(nèi)人工飼料配比喂養(yǎng)(具體方法見表1)。

表1 臭椿溝眶象幼蟲人工飼料配置比例

供試線蟲：采用市面上現(xiàn)有的商品化線蟲，小卷蛾斯氏線蟲S.carpocapsaeAll、長尾斯氏線蟲S.longicaudumX-7，均購自浙江綠神天敵生物技術(shù)有限公司。實驗用不同批次的線蟲重復(fù)兩次。

1.2 供試化學(xué)藥劑

供試化學(xué)藥劑商品信息見表2。在王旭(2019)研究基礎(chǔ)上，將上述3種殺蟲劑對臭椿溝眶象幼蟲的LC50設(shè)為基礎(chǔ)濃度，在此基礎(chǔ)濃度上再分別用蒸餾水稀釋5倍、10倍、20倍(簡稱為1/5 LC50、1/10 LC50、1/20 LC50)；即吡蟲啉為153.3、30.66、15.33和7.67 μg/mL，氯氰菊酯為88.97、17.79、8.89和4.45 μg/mL，啶蟲脒為307.89、61.58、30.79、15.39 μg/mL。

表2 殺蟲劑及來源

1.3 藥劑對線蟲存活和侵染率的影響

用蒸餾水將供試線蟲稀釋為100 IJs/mL搖勻，將各藥劑稀釋成所需濃度梯度LC50、1/5 LC50、1/10 LC50和1/20 LC50。取5 mL上述混勻液體移入培養(yǎng)皿(直徑9 cm)在25℃±1℃的黑暗條件下放置24 h，顯微鏡下每個處理隨機檢查1 mL混合液中線蟲的存活數(shù)量，計算存活率。每處理設(shè)3個重復(fù)，以清水線蟲懸浮液作對照。若藥劑對線蟲的致死作用或者亞致死作用沒有超過10%，則繼續(xù)測定該藥劑對線蟲侵染率的影響。

參照魏洪義等(1991)判定昆蟲病原線蟲對藥劑的反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)：(1)死亡：身體僵直或卷曲，不活動，對針刺無反應(yīng)；(2)亞致死：身體卷曲，由于藥劑麻痹作用引起痙攣性或抽搐性活動，對針刺無反應(yīng)或反應(yīng)非常遲緩；(3)不受藥劑影響：與對照線蟲一樣，身體活動舒展或靜止不動，不動的線蟲經(jīng)探針觸碰后反應(yīng)迅速。

1.4 線蟲與藥劑混用對臭椿溝眶象幼蟲的作用效果

將單頭臭椿溝眶象3齡幼蟲放入裝有30 g人工配制飼料的飼養(yǎng)杯中(直徑5 cm、高4.5 cm)。設(shè)藥劑單獨處理、線蟲(200 IJs/蟲)單獨處理、線蟲(200 IJs/蟲)與藥劑混合處理和清水對照。將參試藥劑配成所需濃度備用，將線蟲懸浮液加入?yún)⒃囁巹丛O(shè)定濃度配成系列試劑，搖勻，取1 mL均勻噴施藥劑、線蟲及兩者混合液，使藥劑或線蟲滲入飼料中，以便觸及試驗對象，將蓋子輕蓋，置于25℃±1℃下培養(yǎng)。每個處理10頭幼蟲，3次重復(fù)。處理72 h，每24 h檢查幼蟲存活情況。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析全部在EXCEL、SPSS軟件中進行，處理間經(jīng)方差分析差異顯著后，用Duncan多重比較方法進行顯著性分析。昆蟲病原線蟲對臭椿溝眶象幼蟲的致病力均用死亡率(%)和校正死亡率(%)表示：

由χ2獨立性檢驗判斷線蟲與化學(xué)藥劑對臭椿溝眶象幼蟲的聯(lián)合作用類型(張中潤等, 2006; 王玉東等, 2012)。

M=[MN+MI(1-MN)]

ME=M×N

χ2=(MNI-ME)2/ME

其中，M、ME分別表示線蟲與各藥劑混用對供試?yán)ハx的期望致死率及致死數(shù)；MN和MI分別為線蟲和各藥劑單獨處理供試?yán)ハx的校正死亡率；MNI為線蟲與各藥劑混用對供試?yán)ハx的實際校正死亡率；N為供試?yán)ハx總數(shù)。

線蟲與各藥劑混用后聯(lián)合作用類型的判斷依據(jù)為：當(dāng)χ2< 3.84(df=1和P=0.05)時，顯示兩種殺蟲因子混用表現(xiàn)為相加作用(Additivity)，即兩種殺蟲因子混用后的毒力和各因子毒力的總和相似；當(dāng)χ2≥ 3.84(df=1和P=0.05)及MNIME時，顯示兩種殺蟲因子混用表現(xiàn)為增效作用(Synergism)即兩種殺蟲因子混用后的毒力明顯超過各因子毒力的總和(張中潤等, 2006; 王玉東等, 2012)。

2 結(jié)果與分析

2.1 殺蟲劑對昆蟲病原線蟲存活的影響

分別用吡蟲啉、啶蟲脒和高效氯氰菊酯藥液連續(xù)浸泡2個品系供試線蟲，24 h檢查發(fā)現(xiàn)，在試驗濃度內(nèi)3種殺蟲劑對供試線蟲均無亞致死作用，只有不同程度的死亡現(xiàn)象，但死亡率均未超過10%，且死亡率并隨各藥劑濃度降低而降低。與對照相比，啶蟲脒對線蟲致死率最高，為4.2%，氯氰菊酯次之，吡蟲啉最安全。2個品系線蟲對不同藥劑的耐藥性存在差異(P<0.05)，X-7品系對氯氰菊酯的耐藥性更強一些。3種藥劑低濃度處理線蟲死亡率差異不大，但啶蟲脒引起的死亡率較其它稍高。

表3 不同濃度的化學(xué)殺蟲劑對線蟲死亡率的影響

2.2 線蟲與藥劑對臭椿溝眶象幼蟲的交互作用

2.2.1不同濃度的氯氰菊酯與2個品系線蟲混用對臭椿溝眶象幼蟲的致死效果

參試藥劑氯氰菊酯單獨處理臭椿溝眶象幼蟲表現(xiàn)出較低的致死效果，只有在LC50(88.97 μg/mL)表現(xiàn)出30%左右的致死作用。參試線蟲分別與氯氰菊酯LC50(88.97 μg/mL)混用的致死效果顯著高于低劑量混用效果。氯氰菊酯各濃度與線蟲混用的殺蟲效果(DNI)比氯氰菊酯單用(DI)、線蟲單用(DN)均明顯提高。其中X-7與1/10 LC50(8.89 μg/mL)混用對臭椿溝眶象幼蟲的致死效果為增效作用，比氯氰菊酯單用直接增加了33.34%的死亡率，比線蟲單用直接增加35%的死亡率，而其它劑量與線蟲混用的致死效果則為相加作用(表4)。

表4 2個品系線蟲與氯氰菊酯混用對臭椿溝眶象幼蟲的交互作用

2.2.2不同濃度的吡蟲啉與2個品系線蟲混用對臭椿溝眶象幼蟲的致死效果

結(jié)果顯示吡蟲啉單獨處理臭椿溝眶象幼蟲，幼蟲的死亡率與藥劑濃度成正相關(guān)。低濃度混用致死效果要好于高濃度混用的效果。吡蟲啉和X-7、All混用比單用的致死效果高，死亡率均在50%以上，表現(xiàn)出相加或增效作用；其中1/20 LC50(7.67 μg/mL)與X-7混用表現(xiàn)出增效作用，作用效果為54.17%，效果增加224.96%，高于與All混用的防效(表5)。

表5 2個品系線蟲與吡蟲啉混用對臭椿溝眶象幼蟲的交互作用

2.2.3不同濃度的啶蟲脒與2個品系線蟲混用對臭椿溝眶象幼蟲的致死效果

啶蟲脒單獨處理臭椿溝眶象幼蟲，幼蟲的死亡率與藥劑濃度成正相關(guān)。啶蟲脒的不同濃度梯度與2種線蟲X-7、All混用時，比相同濃度藥劑單用或線蟲單用的致死效果提高，均表現(xiàn)為相加作用。其中X-7與啶蟲脒LC50(307.89 μg/mL)混用比藥劑單用對臭椿溝眶象幼蟲的致死率增加32.36%(表6)。

表6 2個品系線蟲與啶蟲脒混用對臭椿溝眶象幼蟲的交互作用

3 結(jié)論與討論

將昆蟲病原線蟲與化學(xué)殺蟲劑混用，既可以提高臭椿溝眶象幼蟲的防治效果，又可以降低化學(xué)藥劑的污染及延緩害蟲抗藥性的產(chǎn)生，是臭椿溝眶象幼蟲綜合治理的有效手段。昆蟲病原線蟲可以與許多農(nóng)藥兼容并混合使用，但也有多種農(nóng)藥對線蟲的生存會有影響，任何新的線蟲種-農(nóng)藥組合都需要評估相容性(Koppenh?fer and Grewal, 2005)。因此線蟲與殺蟲劑混用并非簡單地將兩者混配，而必須通過對線蟲安全性和適合度的相關(guān)試驗來驗證。昆蟲病原線蟲對不同化學(xué)藥劑的耐受能力不同，選擇對線蟲安全的化學(xué)藥劑也是混用成功的關(guān)鍵(王玉東等, 2012)。

本研究發(fā)現(xiàn)測試的3種化學(xué)藥劑對供試線蟲均無亞致死作用。2種昆蟲病原線蟲對不同殺蟲劑的耐藥性存在差異，其中吡蟲啉造成的線蟲致死率較低，是對線蟲較為安全的混配農(nóng)藥，低濃度氯氰菊酯次之，而啶蟲脒和高濃度氯氰菊酯對2種線蟲的致死率與對照相比顯著提高。Yan等(2012)將環(huán)境友好型殺蟲劑與昆蟲病原線蟲結(jié)合使用，結(jié)果顯示其中使用的氯氰菊酯和吡蟲啉等對線蟲的存活和傳染性無不良影響，與本試驗結(jié)果一致，證實吡蟲啉、氯氰菊酯可與線蟲混用。

Koppenh?fer(2005)和Grewal(2005)等研究說明兩種因子對某一害蟲的聯(lián)合使用，可對害蟲的殺滅速度和死亡率產(chǎn)生拮抗、疊加或增效作用。疊加效應(yīng)表示兩種藥劑相互獨立行動，沒有相互作用；增效作用是指兩種藥劑的聯(lián)合(或補充)作用，其效果比單獨作用藥劑的效果之和更大。在本試驗中，2種線蟲與3種供試藥劑混用后對臭椿溝眶象3齡幼蟲的防治效果存在明顯差異，混用后的殺蟲效果比兩者單用的效果提高。其中線蟲與化學(xué)藥劑 LC50、1/5 LC50劑量混用后均表現(xiàn)疊加作用，1/20 LC50的吡蟲啉、1/10 LC50的氯氰菊酯與S.longicaudumX-7品系混用可產(chǎn)生明顯的增效作用。本研究結(jié)果表明，氯氰菊酯和吡蟲啉可與昆蟲病原線蟲混用，共同防治臭椿溝眶象。

殺蟲劑和昆蟲病原線蟲之間的增效效果，主要是兩種機制：殺蟲劑影響線蟲的行為，或者殺蟲劑影響目標(biāo)害蟲的行為，這種更常見(Koppenh?fer, 2005; Grewal, 2005)。Koppenh?fer 等(2000 b)研究發(fā)現(xiàn)，線蟲與吡蟲啉混用后，吡蟲啉減少蠐螬的防御行為，從而增加線蟲對蠐螬的附著和滲透，即通過藥劑降低目標(biāo)害蟲對線蟲的防御能力，從而利于線蟲的侵染；另外藥劑可能刺激線蟲的感受神經(jīng)，使線蟲興奮活性提高，導(dǎo)致線蟲的搜索和攻擊能力增強(Koppenhetal.1998; 武海斌等, 2014)。出于成本考慮本文主要對低劑量濃度進行了研究，并根據(jù)結(jié)果推測低劑量的化學(xué)殺蟲劑可能更有助于昆蟲病原線蟲侵害臭椿溝眶象幼蟲。Koppenh?fer(2000)、Triggiani(1976)等研究發(fā)現(xiàn)，低劑量藥劑能引起目標(biāo)昆蟲代謝活動的變化，使其釋放物如CO2、分泌物等增多，而線蟲對這些物質(zhì)敏感。而高濃度藥劑因為對線蟲的存活有明顯影響，可能抑制了線蟲的活力。本研究未設(shè)計試驗進行協(xié)同作用出現(xiàn)原因及低劑量效果較好原因的具體驗證，未來需進一步研究。

在2種供試線蟲中，X-7品系與3種藥劑混用對臭椿溝眶象幼蟲致死效果提升要均高于All品系與藥劑的混用效果，因此 X-7品系可作為優(yōu)選品系，進一步研究其與藥劑混用對林間臭椿溝眶象幼蟲的防治效果。近年來關(guān)于EPN防控鉆蛀性害蟲應(yīng)用技術(shù)的研究逐漸增多，陸永躍(2012)對應(yīng)用昆蟲病原線蟲防治香蕉假頸象甲的施用方法進行研究發(fā)現(xiàn)，將線蟲液注入蛀道的注射法最優(yōu)。目前國內(nèi)林地野外應(yīng)用昆蟲病原線蟲的技術(shù)還不成熟，仍處初步探索階段。臭椿溝眶象幼蟲鉆蛀危害，隱蔽生活，如何采用合適的施用方法讓線蟲制劑接觸到蟲體是林間應(yīng)用的難點。此外，面對寧夏干燥、紫外線強等環(huán)境特點，避免或改善對線蟲不利的環(huán)境因子也是未來要重點考慮的方面。納米技術(shù)、滲透處理等新方法或許可以為昆蟲病原線蟲抵抗惡劣環(huán)境提供新途徑，同時針對臭椿溝眶象幼蟲線蟲和殺蟲劑組合使用的經(jīng)濟可行性還需進一步研究。