楊海燕，胡凱平，宋水林，王廣利，徐 業(yè)，王建國，李小珍*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，南昌 330045；2.江西農(nóng)業(yè)大學產(chǎn)業(yè)處，南昌 330045)

昆蟲生殖系統(tǒng)是內(nèi)生細菌生長、發(fā)生和繁殖的理想場所，在長期特定環(huán)境的進化過程中，昆蟲生殖系統(tǒng)與內(nèi)生細菌之間相互選擇、相互適應，導致不同來源、不同性別、不同發(fā)育階段昆蟲生殖系統(tǒng)內(nèi)生細菌屬種存在差異(Huangetal., 2010)。在昆蟲生殖系統(tǒng)中，不同內(nèi)生細菌屬種，具有不同生理功能。例如，豆蚜Acyrthosiphonpisum生殖系統(tǒng)共生菌Buchneraaphidicola能促進豆蚜的生長和繁殖(Douglas, 1996; Russelletal., 2013)；地中海實蠅Ceratitiscapitata生殖系統(tǒng)中克雷伯氏菌Klebsiellaoxytoca能夠延長成蟲壽命，提高成蟲交配能力(Beharetal., 2008)；伯克氏菌屬Burkholderia能夠促進昆蟲生殖系統(tǒng)卵黃生成素的沉積，提高昆蟲的產(chǎn)卵能力(Leeetal., 2017)。因此，研究雌雄昆蟲生殖系統(tǒng)內(nèi)生細菌屬種及內(nèi)生細菌在性別間的差異，對進一步探索昆蟲生殖系統(tǒng)內(nèi)生細菌的功能，及其對昆蟲生殖行為和生殖能力的調(diào)控有積極意義。

橘小實蠅Bactroceradorsalis(Hendel)屬雙翅目Diptera實蠅科Tephritidae，是美國、日本和韓國等國家的重要檢疫性害蟲(張彬等, 2008; Wanetal., 2011)。橘小實蠅寄主多，能夠為害柑橘、芒果和楊桃等46科250多種果蔬作物(胡凱平等, 2019; Zidaetal., 2020)；成蟲營兩性生殖，具有極強的繁殖和擴張能力，每雌可產(chǎn)卵400～1 800粒，每年可擴張50～100 km(Duycketal., 2004; Lietal., 2019)。橘小實蠅雌雄成蟲生殖系統(tǒng)中的內(nèi)生細菌存在差異，能夠調(diào)控橘小實蠅種群的生殖行為和生殖能力，進而影響到種群在田間的發(fā)生、危害與擴張(Yaoetal., 2016)。目前橘小實蠅腸道內(nèi)生細菌已經(jīng)受到科研人員的廣泛關注(Wangetal., 2011; Wangetal., 2014)；而生殖系統(tǒng)內(nèi)生細菌的研究相對較少。僅王莉莉(2011)研究了室內(nèi)飼養(yǎng)的橘小實蠅生殖系統(tǒng)中的細菌群落，并在雌性成蟲生殖系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)植生拉烏爾菌Raoultellaplanticola、產(chǎn)氣腸桿菌Enterobacteraerogenes、日溝維腸桿菌E.gergoviae和河生腸桿菌E.amnigenus等10種可培養(yǎng)菌群；而Shietal.(2012)發(fā)現(xiàn)，橘小實蠅雌性生殖系統(tǒng)的5種內(nèi)生細菌，包括土生拉烏爾菌R.terrigena、產(chǎn)酸克雷伯氏菌K.oxytoca和肺炎克雷伯菌K.pneumoniae等的代謝產(chǎn)物，對橘小實蠅成蟲本身具有一定的引誘作用。這些研究為揭示橘小實蠅生殖系統(tǒng)內(nèi)生細菌的群落構(gòu)成，分析內(nèi)生細菌的生理功能提供了信息。

然而，由于橘小實蠅生殖系統(tǒng)內(nèi)生細菌群落受眾多外界因素影響，致使特定環(huán)境條件下橘小實蠅生殖系統(tǒng)內(nèi)生細菌的組成存在差異。本研究以來源于江西贛南臍橙基地、以臍橙為主要食料的橘小實蠅為研究對象，采用LB培養(yǎng)基，對橘小實蠅雌雄成蟲生殖系統(tǒng)中的內(nèi)生細菌進行分離培養(yǎng)，分析菌株16S rRNA基因擴增序列，明確橘小實蠅雌雄成蟲生殖系統(tǒng)內(nèi)生細菌的多樣性與差異，為進一步研究橘小實蠅生殖系統(tǒng)內(nèi)生細菌在生殖調(diào)控中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 采集橘小實蠅樣本

橘小實蠅樣本采集時間為2018年9月中旬，采集地點為江西贛南臍橙基地(東經(jīng)114°00′～114°40′，北緯25°42′～26°01′)。采集橘小實蠅樣本時，收集攜帶橘小實蠅卵和幼蟲的贛南臍橙果實，帶回江西農(nóng)業(yè)大學昆蟲實驗室，在溫度28℃±1℃、相對濕度60%～90%和自然光照條件下，用贛南臍橙果實果肉組織飼養(yǎng)；老熟幼蟲轉(zhuǎn)移到用高溫消毒后的沙土中，化蛹；成蟲用酵母粉、清水和濃度為15%蜂蜜稀釋液飼養(yǎng)10 d，收集成蟲置于-20℃冰箱中保存、備用。

1.2 提取生殖系統(tǒng)

選取無病變、品相良好的橘小實蠅雌雄成蟲各10頭，無菌水沖洗干凈。在超凈工作臺內(nèi)用75%酒精沖洗2次，每次2 min，倒掉酒精；用無菌水漂洗3次，去除雜質(zhì)；再在加有少量無菌水的培養(yǎng)皿中解剖，取出雌雄成蟲生殖系統(tǒng)，放入2 mL EP管中，加入1 mL無菌水后充分研磨混勻，用于內(nèi)生細菌培養(yǎng)。雌雄成蟲各重復3次。

1.3 培養(yǎng)生殖系統(tǒng)內(nèi)生細菌

上述配制的菌液，用無菌水按照10-2～10-5進行梯度稀釋，移液槍吸取50 μL，置于LB培養(yǎng)基上，用無菌涂布棒涂布均勻，靜置10 min，將培養(yǎng)基移至32℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)。培養(yǎng)2 d后，用接種環(huán)挑取生長良好的不同形態(tài)或顏色性狀的單菌落，采用稀釋涂布劃線法，在提前準備好的經(jīng)過滅菌消毒的LB培養(yǎng)基上進行劃線培養(yǎng)，得到單一純菌落。將純化后的菌株轉(zhuǎn)至NA培養(yǎng)基斜面上，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。各稀釋菌液均重?次。

1.4 觀察菌落的表觀特征

接種環(huán)挑取NA斜面上的純菌株，再次接入LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d，觀察記錄菌落形態(tài)、顏色、隆起度、邊緣形狀、表面狀態(tài)、光澤、干濕情況、透明度、細菌形狀、芽孢有無和革蘭氏染色等特征。

1.5 擴增16S rRNA基因片段

無菌條件下，挑取NA斜面上的純菌株，接入1 mL高壓滅過菌的NB液態(tài)培養(yǎng)基中，在32℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)3 d。菌液PCR擴增反應的上游細菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和下游細菌通用引物1492R(5′-TACGACTTAACCCCAATCGC-3′)，均由上海生物工程股份技術(shù)有限公司合成。PCR反應體系共30 μL：10×PCR bufferⅡ(with Mg2+)3.0 μL，dNTP Mixture 0.5 μL，968GC和L1401各0.5 μL，菌液1 μL，TaKaRaLaTaq酶(5 U/μL)0.5 μL，ddH2O 24.0 μL。PCR反應條件：95℃預變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃復性1 min；循環(huán)30次，72℃延伸10 min，4℃保溫。擴增的PCR產(chǎn)物送美因基因公司檢測并測序。

1.6 分析可培養(yǎng)細菌屬種

利用DNAstar軟件對得到的序列進行編輯、整理，然后在NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST數(shù)據(jù)庫檢索和同源性比對，找出同源性最高的序列。利用Clustal X軟件對測序獲得的16S rRNA基因序列和與之近緣的已知序列進行多序性匹配排列，確定測試序列代表的細菌分類地位(Saitou and Nei, 1987; Thompsonetal., 1997)。

2 結(jié)果與分析

2.1 可培養(yǎng)細菌的菌落特征

采用LB培養(yǎng)基，從飼養(yǎng)10 d的橘小實蠅雌雄成蟲生殖系統(tǒng)中，培養(yǎng)出具有不同形態(tài)或顏色性狀的細菌15株。其中，雌性成蟲9株，雄性成蟲6株。不同菌株菌落，顏色多變，但多為白色、灰白色、黃白色或黃色。革蘭氏染色表明，15株細菌菌落中11株呈革蘭氏染色陰性反應，4株呈革蘭氏染色陽性反應。顯微鏡觀察顯示，13株細菌呈桿狀，2種呈球狀(表1)。這些細菌均可以在32℃條件下生長，培養(yǎng)2～3 d后菌落形態(tài)、顏色性狀明顯。

2.2 可培養(yǎng)細菌屬種鑒定

以橘小實蠅雌雄成蟲生殖系統(tǒng)分離培養(yǎng)出來的15株細菌，分別配制的菌液為模板，對菌株16S rRNA基因進行擴增。擴增產(chǎn)物送美因基因公司檢測、測序，比對鑒定可培養(yǎng)菌株屬種。

測得的序列提交到NCBI進行blast同源性比對，發(fā)現(xiàn)橘小實蠅雌性生殖系統(tǒng)可培養(yǎng)的9株細菌來自4門、9屬。變形菌門Proteobacteria內(nèi)有4屬，不動桿菌屬Acinetobacter，蒼白桿菌屬Ochrobactrum、無色桿菌屬Achromobacter和劍菌屬Ensifer；擬桿菌門Bacteroidetes內(nèi)有2屬，金黃桿菌屬Chryseobacterium和鞘脂桿菌屬Sphingobacterium；放線菌門Actinobacteria內(nèi)有2屬，微桿菌屬Microbacterium和細球菌屬Micrococcus；厚壁菌門Firmicutes內(nèi)1屬，芽孢桿菌屬Bacillus。橘小實蠅雄性成蟲生殖系統(tǒng)可培養(yǎng)的6株細菌來自3門、6屬。變形菌門內(nèi)有3屬，不動桿菌屬、蒼白桿菌屬和假單胞菌屬；擬桿菌門內(nèi)2屬，金黃桿菌屬和擬桿菌屬Bacteroides；厚壁菌門1屬，芽孢桿菌屬(表2)。

對比分析表明，橘小實蠅雌雄成蟲生殖系統(tǒng)共有4個相同的細菌屬，分別是不動桿菌屬、蒼白桿菌屬、金黃桿菌屬和芽孢桿菌屬。雌性成蟲生殖系統(tǒng)特有的細菌屬，無色桿菌屬、劍菌屬、鞘脂桿菌屬、微桿菌屬和細球菌屬；雄性成蟲生殖系統(tǒng)特有的細菌屬，假單胞菌屬和擬桿菌屬(表2)。

表2 橘小實蠅雌雄成蟲生殖系統(tǒng)的可培養(yǎng)細菌屬種

2.3 可培養(yǎng)的優(yōu)勢細菌屬

橘小實蠅雌雄成蟲生殖系統(tǒng)可培養(yǎng)細菌各屬菌株數(shù)量所占比例不同。變形菌門內(nèi)的不動桿菌屬菌株所占比例最高，分別占雌雄成蟲生殖系統(tǒng)菌株數(shù)量的35.00%和31.58%，為可培養(yǎng)細菌的優(yōu)勢菌屬。此外，在雌成蟲生殖系統(tǒng)中，蒼白桿菌屬、無色桿菌屬、擬桿菌屬和鞘脂桿菌屬所占比例較高；在雄成蟲生殖系統(tǒng)中，微桿菌屬和芽孢桿菌屬所占比例較高(圖1)。

圖1 橘小實蠅雌雄成蟲生殖系統(tǒng)不同細菌屬的比例

3 結(jié)論與討論

本研究從橘小實蠅雌性成蟲生殖系統(tǒng)中，分離培養(yǎng)出內(nèi)生細菌9株，分別是不動桿菌屬、蒼白桿菌屬、無色桿菌屬、劍菌屬、金黃桿菌屬、鞘脂桿菌屬、微桿菌屬、細球菌屬和芽孢桿菌屬；從雄性成蟲生殖系統(tǒng)中，分離培養(yǎng)出內(nèi)生細菌6株，分別是不動桿菌屬、蒼白桿菌屬、假單胞菌屬、金黃桿菌屬、擬桿菌屬和芽孢桿菌屬。這與王莉莉(2011)從橘小實蠅雌雄成蟲生殖系統(tǒng)中分離培養(yǎng)出的內(nèi)生細菌屬種存在差異。可能原因，一是本研究種群來源于江西贛南臍橙基地，以臍橙為主要食料，飼養(yǎng)到成蟲后直接研究細菌屬種構(gòu)成；而王莉莉(2011)的研究種群來源于廣東出入境檢驗檢疫部門，以香蕉為主要食料，且在室內(nèi)飼養(yǎng)多代。二是分離培養(yǎng)條件不一致，雖然都采用了LB培養(yǎng)基，但培養(yǎng)基的制備、培養(yǎng)的溫度和時間設置存在差異。三是測試方法亦存在差異，本研究通過擴增16S rRNA基因片段，然后分析鑒定細菌屬種；而相關研究則采用高通量測序技術(shù)來分析橘小實蠅生殖系統(tǒng)細菌屬種(王莉莉, 2011)。因此，研究材料來源、分離培養(yǎng)和測試方法的差異，決定本研究與前人的研究結(jié)果并不一樣。

本研究結(jié)果表明，橘小實蠅雌性成蟲生殖系統(tǒng)中的內(nèi)生細菌門、屬，均比雄性多。昆蟲生殖系統(tǒng)中的內(nèi)生細菌與昆蟲的性別、發(fā)育階段以及昆蟲所處的外界環(huán)境條件密切相關(Beharetal., 2008; Sharonetal., 2010)。由于實驗所用的橘小實蠅成蟲的發(fā)育階段一致且來自同一采樣地點，具有相似的發(fā)育階段和外界條件。因此，本研究橘小實蠅雌雄成蟲生殖系統(tǒng)內(nèi)生細菌的屬種變化，可能與橘小實蠅的性別有關。

橘小實蠅雌雄成蟲生殖系統(tǒng)均含有不動桿菌屬、蒼白桿菌屬、金黃桿菌屬和芽孢桿菌屬，其中不動桿菌屬為優(yōu)勢可培養(yǎng)內(nèi)生細菌屬。除橘小實蠅外，研究證實不動桿菌屬在南瓜實蠅B.tau(駱米娟等, 2016)和按實蠅Anastrephaludens腸道(Lyudmilaetal., 2001)、澤蘭實蠅Procecidocharesutilis幼蟲體內(nèi)(蘭明先等, 2018)、番石榴實蠅B.orrecta成蟲體內(nèi)(戴陽等, 2020)等多種雙翅目昆蟲中具有分布。因此，可認為不動桿菌屬在雙翅目實蠅科昆蟲中普遍存在。有報道，蒼白桿菌屬在番石榴實蠅成蟲體內(nèi)具有分布(戴陽等, 2020)；芽孢桿菌屬在澤蘭實蠅幼蟲體內(nèi)具有分布(蘭明先等, 2018)；但未查到相關文獻，金黃桿菌屬在相關實蠅昆蟲體內(nèi)具有分布。

橘小實蠅雌成蟲特有的細菌有無色桿菌屬、鞘脂桿菌屬、微桿菌屬、細球菌屬和劍菌屬。其中，無色桿菌屬和細球菌屬在瓜實蠅B.cucurbitae體內(nèi)有分布(姚明燕等, 2017)；鞘脂桿菌屬、微桿菌屬和細球菌屬在多種鱗翅目昆蟲棉鈴蟲Helicoverpaarmigera、稻縱卷葉螟Cnaphalocrocismedinalis、菜青蟲Pierisrapae和甜菜夜蛾Spodopteraexergual腸道中發(fā)現(xiàn)，鞘脂桿菌屬能夠誘導細胞發(fā)生程序性死亡(楊焊, 2012)；劍菌屬多在植物尤其是豆科植物中廣泛分布，與植物固氮作用有關(陳文峰, 2016)，昆蟲中未查到相關文獻。雄成蟲特有的細菌屬有假單胞菌屬和擬桿菌屬。研究證實，假單胞菌屬在墨西哥實蠅(Lyudmilaetal., 2001)和南瓜實蠅雄成蟲(駱米娟等, 2016)體內(nèi)亦有分布，能抵御有害病原真菌的侵入與危害(Indiragandhietal., 2007)；擬桿菌屬在100 Gy137Cs輻照后的瓜實蠅腸道亦有發(fā)現(xiàn)(姚明燕等, 2017)。至于這些特異性細菌屬種在橘小實蠅雌雄成蟲生殖系統(tǒng)中所起的作用，目前仍不清楚。

本研究從橘小實蠅雌雄成蟲生殖系統(tǒng)，分離出不同性狀的細菌15株，分屬4門，11屬，明確雌雄間內(nèi)生細菌屬種存在差異。仍需要從二方面進行研究，一方面是需要根據(jù)細菌屬種的營養(yǎng)需求和生化特點，來設計針對性的培養(yǎng)基類型，從而分離純化更多可培養(yǎng)的細菌屬種；另一方面需要對分離純化的各細菌屬種的生化特點和生物學功能進行研究、探索。本研究對橘小實蠅雌雄成蟲生殖系統(tǒng)可培養(yǎng)內(nèi)生細菌屬種的比較研究，為優(yōu)化培養(yǎng)基質(zhì)和培養(yǎng)條件、探索生殖系統(tǒng)相關細菌的代謝和功能提供信息。