茍 英，吳東葉，黃啟林，王明義*

（1.西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院婦產(chǎn)科，成都 610083；2.西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院普外科，成都 610083）

重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是一種以胰腺局部炎性損傷和全身炎癥反應為特征的疾病，其病情重、并發(fā)癥多、病死率高[1]。SAP發(fā)病早期常伴有腸屏障功能障礙，導致腸道內(nèi)細菌和有毒物質(zhì)進入血循環(huán)引起腸源性感染，加重患者病情。間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）因具有顯著的抗炎與免疫調(diào)節(jié)能力，已被廣泛應用于炎癥性疾病的治療與研究。本研究主要探討外源性P-MSCs移植能否改善SAP大鼠腸屏障功能。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑

健康成年雄性SPF級SD大鼠，體質(zhì)量200～220 g，購自成都達碩實驗動物有限公司。間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基購自友康恒業(yè)生物科技（北京）有限公司。牛磺膽酸鈉購自美國Sigma公司。CMDil細胞染料購自美國賽默飛公司。KGF、D-乳酸、內(nèi)毒素、IL-1β、TNF-α與CRP檢測試劑盒均購自上海江萊生物科技有限公司。CCK-8試劑盒購自東仁化學科技（上海）有限公司。兔抗大鼠ZO-1與Occludin抗體購自英國Abcam公司。

1.2 胎盤間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)

胎盤間充質(zhì)干細胞來自我院普外科湯禮軍教授課題組饋贈，采用間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，具體培養(yǎng)方法詳見HUANG等[2]研究。

1.3 模型制備及分組

24只SD大鼠，術前禁食12 h，自由飲水，采用隨機數(shù)字表法分為SHAM組、SAP組與SAP+P-MSCs組，各8只。SHAM組：大鼠經(jīng)異氟烷吸入麻醉后，開腹翻動胰腺數(shù)次然后關閉腹腔，術后6 h經(jīng)尾靜脈注射1 mL PBS緩沖液。SAP組：大鼠麻醉后開腹，經(jīng)胰膽管采用微量輸液泵輸注4%牛磺膽酸鈉（0.1 mL·100 g-1），術后6 h經(jīng)尾靜脈注射1mL PBS緩沖液。SAP+P-MSCs組：SAP建模術后6 h，經(jīng)尾靜脈注射P-MSCs（1×106個·100 g-1）。所有大鼠術后禁食不禁水，于P-MSCs輸注24 h后麻醉開腹，經(jīng)腹主動脈采血，然后離心（3 500 rpm，5 min），收集血清保存于-80℃?zhèn)溆?。無菌條件下采集大鼠胰腺與腸系膜淋巴結組織，置于4℃ 1×PBS緩沖液中用于后續(xù)細菌培養(yǎng)。剪取末端回腸組織，2份置于凍存管中保存于-80℃?zhèn)溆茫?份置于4%多聚甲醛中固定，1份置于電鏡固定液用于后續(xù)電鏡檢測。

1.4 P-MSCs體內(nèi)示蹤

采用CM-Dil細胞染料標記P-MSCs，并觀察CM-Dil對P-MSCs增殖的影響。10只雄性健康SD大鼠，體質(zhì)量（200±10）g，采用隨機數(shù)字表法分為SHAM+P-MSCs組與SAP+P-MSCs組（每組5只），于術后6 h經(jīng)尾靜脈輸注CM-Dil標記的P-MSCs（1×106個·100 g-1）。P-MSCs移植24 h后進行取材，大鼠麻醉后處死，采集末端回腸組織，置于4%多聚甲醛中固定。對腸道組織進行冰凍切片，DAPI復染核后置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 CCK-8實驗測定細胞增殖活性

采用CCK-8實驗檢測CM-Dil對P-MSCs增殖的影響，具體實驗步驟參照試劑盒說明書，最后測定其在450 nm處的OD值。

1.6 腸道組織病理學檢測

首先，采用HE染色觀察腸道病理改變。固定后的腸道組織，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟、HE染色后，置于顯微鏡下觀察其病理改變。透射電鏡檢測，首先將腸道組織修剪成0.5～1.0 mm2大小，然后置于3%戊二醛預固定，經(jīng)丙酮脫水后，再依次進行滲透、包埋與超薄切片，最后用醋酸鈾染色，再用檸檬酸鉛染色，采用H-600IV型透射電鏡進行觀察。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附測定

采用ELISA法測定大鼠血清中D-乳酸、內(nèi)毒素、IL-1β、TNF-α與CRP濃度，操作按試劑盒說明書步驟進行。腸道組織中TNF-α、IL-1β與KGF的測定，首先取-80℃凍存的腸道組織，稱取相同質(zhì)量，然后超聲波勻漿后離心收集上清，并采用全蛋白提取試劑盒提取總蛋白，采用ELISA法進行測定。

1.8 細菌移位的檢測

無菌條件下采集大鼠腸系膜淋巴結與胰腺組織各50 mg，加入1 mL無菌生理鹽水，在無菌玻璃勻漿管中勻漿，再將勻漿液稀釋100倍。分別取10 μL稀釋液均勻涂布接種于血瓊脂培養(yǎng)皿與麥康凱培養(yǎng)皿上，置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結束后計數(shù)細菌菌落數(shù)，計算每克組織培養(yǎng)出的細菌菌落形成單位數(shù)（clonal formation unit，CFU），即CFU·g-1=平板菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)/組織質(zhì)量（g）。

1.9 腸道組織ZO-1與Occludin蛋白表達水平測定

采用Western-blot法檢測腸道組織中ZO-1與Occludin蛋白表達水平。剪取適量等質(zhì)量的腸道組織，磨碎后提取總蛋白。進行常規(guī)的電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，分別與抗ZO-1與Occludin抗體（1:500）4℃孵育過夜。用TBST洗滌后，加入二抗（1:2 000）孵育30 min，采用化學發(fā)光法進行檢測。

1.10 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，若方差齊則采用單因素的方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；若方差不齊，則多組間比較采用非參數(shù)檢驗Kruskal-WallisH法，進一步兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 實驗結果

2.1 P-MSCs減輕SAP大鼠腸道損傷

腸道HE染色結果顯示，SHAM組結構完整，未見明顯異常；SAP組可見固有層崩解，絨毛缺損，間質(zhì)內(nèi)有大量炎性細胞浸潤及明顯組織水腫；而SAP+P-MSCs組相較SAP組腸道損傷得到明顯改善（圖1）。腸道透射電鏡結果顯示：SHAM組腸道上皮細胞微絨毛排列整齊，上皮細胞結構完整，線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等細胞器結構清晰，細胞間緊密連接清晰；SAP組腸上皮細胞微絨毛排列稀疏，線粒體腫脹明顯，緊密連接顯著破壞；SAP+P-MSCs組腸上皮細胞微絨毛排列相對整齊，線粒體輕微腫脹，緊密連接相對完整（圖2）。腸道HE染色與透射電鏡結果，表明外源性P-MSCs移植可減輕SAP大鼠腸道損傷。

圖1 腸道組織HE染色（×200）

圖2 腸道組織透射電鏡下病理改變（箭頭指示為緊密連接，×25 000）

2.2 P-MSCs向損傷部位定植

將CM-Dil細胞染料標記的P-MSCs置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)CM-Dil對P-MSCs的增殖及形態(tài)無明顯影響（圖3A，B）。通過CCK-8實驗再次證實CM-Dil對P-MSCs的增殖無明顯影響（圖3C）。將CM-Dil標記的P-MSCs通過尾靜脈輸注到SAP大鼠體內(nèi)，最后在熒光顯微鏡下觀察P-MSCs在腸道的定植情況。如圖4所示，相比SHAM+PMSCs組，SAP+P-MSCs組腸道組織中有更多的P-MSCs定植。以上結果表明，采用CM-Dil標記P-MSCs安全有效，并且P-MSCs傾向于在損傷腸道組織中募集。

圖3 P-MSCs傾向于在損傷腸道組織中定植

圖4 CM-Dil標記的P-MSCs在腸道中的定植情況（×200）

2.3 P-MSCs減輕SAP大鼠全身炎癥反應

ELISA檢測結果表明：相比SHAM組，SAP組大鼠血清中IL-1β、TNF-α與CRP濃度顯著增加（P＜0.001）；相比SAP組，SAP+P-MSCs組大鼠血清中IL-1β、TNF-α與CRP濃度顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）（圖5）。說明外源性P-MSCs移植可減輕SAP大鼠全身炎癥反應。

圖5 P-MSCs減輕SAP大鼠全身炎癥反應程度

2.4 P-MSCs減輕SAP大鼠腸道炎癥反應

如圖6A，B所示，相比SHAM組，SAP組腸道組織中促炎因子TNF-α與IL-1β水平顯著升高（P＜0.001）；給予P-MSCs治療后，SAP大鼠腸道組織中TNF-α與IL-1β水平顯著降低（P＜0.001）。說明P-MSCs移植可減輕SAP大鼠腸道炎癥反應。此外還發(fā)現(xiàn)，SAP組腸道組織中KGF含量較SHAM組顯著升高（P＜0.01）；相比SAP組，SAP+PMSCs組腸道組織中KGF含量進一步升高（P＜0.01，圖6C）。

圖6 P-MSCs減輕SAP大鼠腸道炎癥反應

2.5 P-MSCs改善SAP大鼠腸屏障功能

本研究發(fā)現(xiàn)，SAP組血清D-乳酸與內(nèi)毒素濃度顯著高于SHAM組（P＜0.001）；給予P-MSCs治療后，血清D-乳酸與內(nèi)毒素濃度均明顯降低（P＜0.001，圖7A，B）。通過對不同組進行細菌菌落計數(shù)，并對結果進行對數(shù)轉(zhuǎn)化分析后發(fā)現(xiàn)，相比SHAM組，SAP組胰腺與腸系膜淋巴結組織培養(yǎng)獲得的細菌菌落數(shù)顯著增加（P＜0.001）；給予P-MSCs治療后，胰腺與腸系膜淋巴結組組織培養(yǎng)獲得的細菌菌落數(shù)顯著減少（P＜0.05，圖7C）。腸道組織中ZO-1和Occludin的Western-blot檢測結果表明：相比SHAM組，SAP組ZO-1與Occludin的表達量顯著下降（P＜0.001）；而給予P-MSCs治療后可增加ZO-1與Occludin的表達，與SAP組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖7D，E）。綜上所述，P-MSCs可改善SAP大鼠腸屏障功能。

圖7 P-MSCs可改善SAP大鼠腸黏膜屏障功能

3 討論

MSCs因其具有顯著的抗炎與免疫調(diào)節(jié)作用，被廣泛用于炎癥性疾病的治療與研究。已有研究表明，外源性MSCs移植可減輕SAP相關性腸損傷。2012年，TU等[3]發(fā)現(xiàn)同種異體BM-MSCs移植可減輕SAP大鼠小腸上皮炎癥與損傷，促進腸上皮細胞增殖與黏膜修復，改善腸屏障功能。

P-MSCs是從胎兒胎盤組織中分離培養(yǎng)獲得，胎兒分娩后胎盤組織常被當作醫(yī)療廢棄物拋棄，因此從胎盤組織中分離培養(yǎng)P-MSCs具有無創(chuàng)性。此外，相比BM-MSCs，P-MSCs不但具有組織來源豐富、組織中MSCs含量豐富、倫理限制少等優(yōu)點，而且還具有更強的增殖與免疫調(diào)節(jié)能力[4-5]。研究[6]發(fā)現(xiàn)，相比UC-MSCs，P-MSCs具有更強的增殖與免疫調(diào)節(jié)能力。

SAP早期是一種無菌性炎癥反應，炎癥反應相對較輕，而后期出現(xiàn)的嚴重全身炎癥反應及高死亡率被認為與腸道通透性改變導致腸道細菌移位以及腸道有毒物質(zhì)進入血液循環(huán)有關[7]。因此，改善SAP患者腸屏障功能對于緩解病情、減少并發(fā)癥、降低病死率等均具有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)外源性P-MSCs移植可減輕SAP大鼠全身炎癥反應與腸道損傷，改善腸屏障功能。

大量研究證實，MSCs具有向組織損傷部位遷移與定植的特性。MSCs在組織損傷部位定植對充分發(fā)揮其治療作用至關重要。JIANG等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在缺血-再灌注腸道損傷大鼠模型中，外源性BMMSCs也傾向于在損傷腸道組織中定植。本研究發(fā)現(xiàn)相比SHAM+P-MSCs組，SAP+P-MSCs組腸道組織中有更多P-MSCs定植，說明在SAP大鼠體內(nèi)，外源性移植的P-MSCs有向損傷腸道募集的趨勢。

D-乳酸與內(nèi)毒素由腸道細菌產(chǎn)生，腸屏障功能正常時，其幾乎不能進入血循環(huán)。當腸屏障功能受損時，大量D-乳酸與內(nèi)毒素可進入血循環(huán)，因此其常作為腸屏障損傷的早期指標。此外，當腸屏障出現(xiàn)嚴重損傷時，腸道中細菌也可進入血循環(huán)，導致腸源性感染。腸上皮細胞間緊密連接對維持腸屏障功能完整性至關重要。研究[9]證實，ZO-1與Occludin蛋白在腸上皮細胞間緊密連接中扮演著重要角色。本研究給予外源性P-MSCs治療后，SAP大鼠血清D-乳酸與內(nèi)毒素濃度顯著降低，并且胰腺與腸系膜淋巴結組織培養(yǎng)獲得細菌菌落數(shù)也顯著減少，此外腸道組織中ZO-1與Occludin蛋白表達也顯著升高，說明P-MSCs可改善SAP大鼠腸屏障功能。

本研究觀察到給予外源性P-MSCs治療后，SAP大鼠血清與腸道組織中TNF-α與IL-1β濃度均顯著降低。角化細胞生長因子（keratinocyte growth factor，KGF）可促進腸道黏膜上皮細胞增殖與分化，加速腸道損傷上皮細胞修復[10]。本研究發(fā)現(xiàn)P-MSCs治療后，SAP大鼠腸道組織中KGF含量顯著升高，說明P-MSCs可促進腸道上皮細胞再生。

綜上所述，本研究初步表明外源性P-MSCs移植可減輕SAP大鼠腸道損傷，改善腸屏障功能，但P-MSCs改善腸屏障功能的具體機制尚不清楚，仍有待進一步深入探討。