韓金志，潘雯麗，沈 昊，汪少蕓

（福州大學生物科學與工程學院 福州350108）

乳酸菌是一類GRAS（Generally Regarded As Safety）級食品微生物，已廣泛應用于發(fā)酵食品，可發(fā)揮抗菌、防腐，賦予食品特殊風味以及提高營養(yǎng)品質等功能[1]。目前，用于生產發(fā)酵食品的乳酸菌大概有20 余種，如：保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌用于生產酸奶，德式乳桿菌用于發(fā)酵畜產品，干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌用于生產乳酪等[2-4]，植物乳桿菌是酸菜發(fā)酵生產中的優(yōu)勢菌株[5]。以上這些傳統(tǒng)的乳酸菌發(fā)酵食品各自具有獨特的風味，深受消費者青睞。

豆?jié){是一類通常以大豆為原材料制成的傳統(tǒng)植物蛋白飲料，在豆?jié){的基礎上經(jīng)乳酸菌等菌株發(fā)酵可制成發(fā)酵豆?jié){。與傳統(tǒng)豆?jié){相比，發(fā)酵豆?jié){中的大豆蛋白能被分解為氨基酸和寡肽，更易于人體的吸收，同時破壞豆?jié){中的凝血素、胰蛋白酶抑制劑、脹氣因子等抗營養(yǎng)因子[6]。此外，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵，發(fā)酵豆?jié){被重新賦予新的風味。其中，揮發(fā)性香氣成分的增加或生成是發(fā)酵豆?jié){提升感官品質的重要因素。固相微萃取技術（SPME）是一種無溶劑樣品前處理技術，具有高效、便捷、操作簡單等特點，與GC-MS 技術相結合被廣泛應用于發(fā)酵食品中揮發(fā)性氣味物質的定性、定量分析[7]。相關研究已有大量報道。樊艷等[8]采用基于電子舌與SPME-GC-MS 技術檢測分析了腐乳中的風味物質；王丹等[9]采用SPME-GC-MS 技術分析嗜熱鏈球菌IMAU10638 發(fā)酵乳貯藏期間的揮發(fā)性風味物質變化；馬艷麗等[10]基于SPME-GC-MS 技術比較4 種傳統(tǒng)中式酸凝奶酪與西方切達奶酪中揮發(fā)性風味組分的差別。基于SPME-GC-MS 技術分析發(fā)酵食品中特征性風味物質的組成及產生規(guī)律，對傳統(tǒng)發(fā)酵食品的品質調控和改善具有重要意義。

目前，針對乳酸菌發(fā)酵豆?jié){揮發(fā)性氣味物質組成和特征香氣物質分析的研究較少。本研究選擇在發(fā)酵食品中應用廣泛的5 種乳酸菌：植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、德式乳桿菌（Lactobacillus germani）、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）生產發(fā)酵豆?jié){，并對不同乳酸菌發(fā)酵豆?jié){揮發(fā)性氣味物質的組成與差異性進行分析，旨在為乳酸菌發(fā)酵豆?jié){飲料的開發(fā)與生產提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆?jié){粉購于永和食品（中國）股份有限公司；純凈水，華潤怡寶飲料（中國）有限公司；2-辛醇（分析純），美國Sigma-Aldrich 公司；植物乳桿菌FZU122、干酪乳桿菌FJAT-7928、德式乳桿菌FJAT-46740、發(fā)酵乳桿菌FJAT-46744、嗜熱鏈球菌FJAT-46738，福州大學生物科學與工程學院保藏。

1.2 培養(yǎng)基的配制

MRS 培養(yǎng)基：分別稱取牛肉膏10 g、葡萄糖20 g、酵母提取物5 g、蛋白胨10 g、磷酸氫鉀2 g、無水乙酸鈉5 g、硫酸錳0.25 g、檸檬酸氫二銨2 g、吐溫-80 1 mL、硫酸鎂0.5 g 溶解于1 000 mL蒸餾水中，調pH 值至6.2，121 ℃高壓滅菌20 min。

生理鹽水：稱取8～9 g NaCl 固體，溶解于1 000 mL 去離子水中，121 ℃高壓滅菌20 min。

1.3 儀器與設備

紫外-可見分光光度計（UV-1100 型），上海美普達儀器有限公司；數(shù)顯pH 計（MP511），上海三信儀表廠；氣相色譜質譜聯(lián)用儀（5977A），美國安捷倫科技有限公司；固相微萃取萃取頭，PDMS 30 μm，美國Supelco 公司；SPME 手動進樣柄（57330-U），美國Supelco 公司；恒溫生化培養(yǎng)箱（SPX-150BIII），黃驊菲斯福實驗儀器有限公司；立式高壓滅菌鍋（LDZF-50L-III），上海申安醫(yī)療器械廠；理化分析型超純水機（WP-UP-LH-20），四川沃特爾水處理設備有限公司；分析電子天平（HZK-FA2105），美國康州HZ 電子科技有限公司；高速冷凍離心機（Fresco 17），賽默飛世爾科技（中國）有限公司；電磁攪拌器（OMS-181E），上海歐河機械設備有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 豆?jié){的制備 稱取一定量豆?jié){粉，以10%的比例（質量比）溶解于純凈水，充分攪拌均勻，分裝至200 mL 絲口瓶，121 ℃高壓滅菌20 min，待用。

1.4.2 菌株活化與接種 5 種乳酸菌包括：植物乳桿菌FZU122、干酪乳桿菌FJAT-7928、德式乳桿菌FJAT-46740、發(fā)酵乳桿菌FJAT-46744、嗜熱鏈球菌FJAT-46738，由甘油管分別接種至MRS液體培養(yǎng)基37 ℃靜置培養(yǎng)，經(jīng)活化、轉接培養(yǎng)后，取一定量菌液離心，去除上清液，用生理鹽水洗滌3 次。以生理鹽水作參比溶液，將菌液吸光度（OD600nm）調至0.5～0.6。分別以1%的接菌量接種至100 mL 無菌豆?jié){，每個試驗組設立3 個平行樣，同時設立未發(fā)酵豆?jié){對照組，置恒溫生化培養(yǎng)箱37 ℃條件下靜置發(fā)酵60 h。

1.4.3 pH 值的測定 MRS 液體培養(yǎng)基和豆?jié){經(jīng)不同乳酸菌發(fā)酵后，取樣，用pH 計測定不同乳酸菌發(fā)酵樣品的pH 值，每個試驗組設3 個平行樣。

1.4.4 頂空固相微萃取 取5 mL 樣品置12 mL頂空萃取瓶中，加入1 g NaCl、磁力轉子和10 μL 2-辛醇（10 mg/L，內標物），用密封墊迅速密封樣品瓶，置磁力攪拌器加熱臺上，攪拌速度600 r/min，40 ℃水浴溫育20 min 后插入固相微萃取針，壓出萃取纖維，使其固定在距離液面0.5～1.0 cm處，吸附萃取30 min 后收回萃取纖維，拔出萃取針，插入氣相色譜-質譜聯(lián)用儀中進樣分析。

1.4.5 氣相色譜-質譜聯(lián)用分析 氣相色譜質譜聯(lián)用分析條件[11]：采用DB-WAX 色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），進樣口溫度250 ℃；柱溫箱起始溫度40 ℃，保留8 min，然后以4 ℃/min 升溫至150 ℃，再以20 ℃/min 升溫至250 ℃，保留5 min；不分流進樣，載氣為99.999%高純度氦氣，載氣流速1 mL/min。質譜條件：離子源溫度230 ℃，電離方式為EI，電離能量70 eV，接口溫度250 ℃，四級桿溫度150 ℃，選擇SCAN 模式為掃描方式，定性分析，離子碎片的掃描范圍為30～500m/z，溶劑延遲時間2.5 min。

1.4.6 揮發(fā)性成分的定量分析[12]選擇匹配度≥70，采用內標法定量分析。將10 μL 質量濃度為10 mg/mL 的2-辛醇和5 mL 待測樣品混合均勻，對含有內標物的樣品通過GC-MS 進行分析。根據(jù)待測樣品和內標物的峰面積，計算待測組分在樣品中的含量。

1.4.7 數(shù)據(jù)處理分析 運用SPSS 19.0 統(tǒng)計分析軟件處理試驗數(shù)據(jù)，采用STAMP 軟件比較組間物質差異，利用Heml 軟件繪制熱圖，應用SIMCA 14.1 軟件進行主成分分析，使用Origin 8.5 軟件和GraphPad 6 軟件繪圖。試驗數(shù)據(jù)為3 次測定的平均值。

2 結果與分析

2.1 不同乳酸菌在發(fā)酵豆?jié){過程中的產酸能力

乳酸菌在食品發(fā)酵過程中，以產生乳酸、苯乳酸、乙酸等有機酸為典型特點，不同乳酸菌在不同的營養(yǎng)條件下的產酸能力亦存在差異性。通?？梢罁?jù)發(fā)酵體系中pH 值的變化來判斷乳酸菌的生長狀態(tài)及發(fā)酵進程。由圖1所示，5 種乳酸菌分別接種至MRS 液態(tài)培養(yǎng)基，發(fā)酵后，5 個發(fā)酵組的pH 值與對照相比均顯著下降，而乳酸菌發(fā)酵組間無顯著性差異，表明5 種乳酸菌在MRS 液體培養(yǎng)基中均可正常生長，且代謝產酸能力相近。然而，5種乳酸菌在豆?jié){中的發(fā)酵產酸能力存在差異。其中，干酪乳桿菌（L.casei）與嗜熱鏈球菌（S.thermophilus）發(fā)酵組產酸能力較強，其次是植物乳桿菌（L.plantarum），再次是德氏乳桿菌（L.germani）和發(fā)酵乳桿菌（L.fermentum）（見圖2）。結果表明，干酪乳桿菌和嗜熱鏈球菌相比其它3 種乳酸菌在豆?jié){發(fā)酵過程中具有更強的發(fā)酵產酸能力。豆?jié){中含有少量棉子糖、水蘇糖等低聚糖以及葡萄糖、果糖、蔗糖，可為乳酸菌生長代謝及乳酸發(fā)酵提供碳源。此外，部分游離氨基酸在脫氨基作用下可產生丙酮酸、延胡索酸、α-酮戊二酸、草酰乙酸等中間產物，進入三羧酸循環(huán)等代謝途徑，亦可為乳酸菌的生長繁殖和發(fā)酵產物合成過程提供碳骨架、能量和還原力。干酪乳桿菌和嗜熱鏈球菌通常用于酸奶、干酪等發(fā)酵乳制品生產，其細胞內代謝系統(tǒng)經(jīng)長期演化獲得對乳制品營養(yǎng)環(huán)境的生物學適應性，由于豆?jié){與動物乳汁營養(yǎng)素組成相近，因此在豆?jié){發(fā)酵過程中同樣表現(xiàn)出較強的發(fā)酵產酸能力。

圖1 不同乳酸菌MRS 培養(yǎng)基發(fā)酵液pH 值Fig.1 pH of MRS midium fermented with different lactic acid bacteria

圖2 不同乳酸菌發(fā)酵豆?jié){的pH 值Fig.2 pH of soybean milk fermented with different lactic acid bacteria

2.2 不同乳酸菌發(fā)酵豆?jié){揮發(fā)性成分的定性分析結果

乳酸菌被廣泛應用于食品發(fā)酵，經(jīng)代謝過程在食品中產生多種香氣物質，賦予發(fā)酵食品特殊的風味。采用GC-MS 分析未發(fā)酵豆?jié){和5 種乳酸菌發(fā)酵豆?jié){中的揮發(fā)性氣味物質，總計檢測出47種揮發(fā)性氣味物質，其中，醛類19.15%、醇類40.43%、酮類12.77%、有機酸類6.38%、酚類6.38%、呋喃類6.38%、脂類等其它物質8.51%。在未發(fā)酵組豆?jié){中檢測到26 種揮發(fā)性氣味物質，以醛類（9 種）、醇類（5 種）、烴類（4 種）和酮類（4）為主。與前人利用頂空固相微萃取技術從豆?jié){中萃取到23 種揮發(fā)性成分：醛類10 種、醇類5 種、酮類3 種、呋喃2 種、酯類1 種、其它類2 種的結果相一致[11]。在乳酸菌發(fā)酵豆?jié){試驗組，植物乳桿菌發(fā)酵組中檢測到40 種揮發(fā)性氣味物質，干酪乳桿菌發(fā)酵組中40 種，德式乳桿菌發(fā)酵組中43 種，發(fā)酵乳桿菌發(fā)酵組中44 種，嗜熱鏈球菌發(fā)酵組中40 種。5 種乳酸菌發(fā)酵組豆?jié){與未發(fā)酵組相比較醛類物質數(shù)量減少，而酚類、酸類、烴類、醇類、酮類物質數(shù)量均增加（見圖3、表1）。

圖3 不同菌種乳酸菌發(fā)酵豆?jié){的揮發(fā)性氣味物質經(jīng)GC-MS 檢測的總離子流圖Fig.3 GC-MS total ion current chromatogram of volatile odorants in soybean milk fermented with different lactic acid bacteria

表1 各樣品中匹配度較高的揮發(fā)性物質數(shù)量Table 1 The number of volatile substances with high matching in each sample

2.3 不同乳酸菌發(fā)酵豆?jié){揮發(fā)性氣味物質定量及差異分析

乳酸菌發(fā)酵豆?jié){過程中糖類、氨基酸、脂肪酸、維生素、醛、酮等物質經(jīng)代謝轉化可產生大量揮發(fā)性氣味物質，從而賦予發(fā)酵豆?jié){新的風味。由圖4所示，未發(fā)酵豆?jié){與5 種乳酸菌發(fā)酵豆?jié){相比，揮發(fā)性氣味物質的差異變化顯著。未發(fā)酵豆?jié){中含有正己醛、苯甲醛、戊醛、壬醛、正辛醛等9 種醛類物質。在這些醛類物質中正己醛、戊醛、壬醛等可產生豆腥味，苯甲醛、2，4-癸二烯醛、反-2-辛烯醛、反，反-2，4-癸二烯醛則對豆?jié){的特有風味有香氣貢獻。5 種乳酸菌發(fā)酵組中，以上9 種醛類物質均顯著下降或部分消失，與前人通過乳酸菌發(fā)酵豆?jié){降低己醛含量，減少豆腥味的研究結果相一致[13]。同時，也解釋了發(fā)酵豆?jié){豆腥味消除，并伴隨著豆?jié){原始香氣特征減弱的原由。此外，5種乳酸菌發(fā)酵豆?jié){中醇類物質與酮類物質種類及含量顯著增多，其中醇類物質中，苯乙醇具有清甜的玫瑰樣花香，正戊醇略帶果香，芳樟醇具有鈴蘭香氣，苯甲醇（定香劑，略帶香氣），正己醇具有水果芬芳香氣，正辛醇具有甜香味，1-壬醇稍有玫瑰和橙子香氣，1-辛烯-3-醇具有蘑菇、薰衣草、玫瑰和干草香氣，這些醇類賦予乳酸菌發(fā)酵豆?jié){鮮香醇厚的特征香氣。在新產生或含量增大的酮類物質中，苯乙酮有山楂的氣味，2-庚酮有類似梨的水果香味，仲辛酮呈蘋果似香氣，3-羥基-2-丁酮呈奶油和脂肪的氣味，2-壬酮呈水果、花、油脂和藥草似香氣。新產生的甲基麥芽酚具有焦奶油硬糖的特殊香氣。這些物質進一步豐富了發(fā)酵豆?jié){的香氣特征。新產生的有機酸，乙酸具有醋酸氣味，正戊酸和正己酸具有汗臭味，這些有機酸的產生使發(fā)酵豆?jié){帶有發(fā)酵酸敗的氣味（見表2）。乳酸菌發(fā)酵豆?jié){的揮發(fā)性氣味物質組成與發(fā)酵乳制品存在較大差異，發(fā)酵乳制品中揮發(fā)性的風味物質主要是有機酸、醇類、醛類、酮類、酯類、烴類以及有氧、氮、硫的雜環(huán)化合物，如呋喃及其衍生物和噻吩及其衍生物[14]，其中對酸奶的風味貢獻度較大的是羧酸類化合物、酮類化合物及醛類化合物，這些風味物質構成了發(fā)酵乳的主體風味[15]，如1-壬烯-3-酮[16]、3-甲基丁醛、苯甲醛、正壬醛、雙乙酰、乙偶姻和2-壬酮等[17-18]。乳酸菌在豆?jié){和動物乳汁中因參與風味物質合成相關的代謝途徑，可能是導致發(fā)酵豆?jié){和酸奶之間風味物質組成存在差異性的主要原因。

圖4 不同乳酸菌發(fā)酵豆?jié){揮發(fā)性氣味物質差異分析熱圖Fig.4 Heat map of the volatile profiles of soybean milks fermented by different LABs

表2 不同乳酸菌發(fā)酵豆?jié){揮發(fā)性氣味物質含量Table 2 Volatile odorants of soybean milk fermented with different lactic acid bacteria

（續(xù)表2）

2.4 不同乳酸菌發(fā)酵豆?jié){復發(fā)性氣味物質聚類分析

使用多元數(shù)據(jù)分析法能清晰地闡明各發(fā)酵豆?jié){樣本間的差異。將不同菌種乳酸菌發(fā)酵豆?jié){樣品中的所有揮發(fā)性氣味物質進行多元數(shù)據(jù)分析，樣本聚類樹分析見圖5。由樣本聚類分析樹狀圖（圖5a）可見，干酪乳桿菌、植物乳桿菌、德氏乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌4 種乳酸菌發(fā)酵豆?jié){揮發(fā)性氣味物質組成相近，與未發(fā)酵豆?jié){、嗜熱鏈球菌發(fā)酵豆?jié){間均存在差異。

圖5 不同乳酸菌發(fā)酵豆?jié){揮發(fā)性氣味物質聚類分析Fig.5 Cluster analysis of volatile odorants in fermented soybean milk with different lactic acid bacteria

圖5b所示，未發(fā)酵豆?jié){的特征化合物是壬醛、正辛醛、戊醛、正己醛、正戊烷、反-2-辛烯醛、反，反-2，4-癸二烯醛；植物乳桿菌、干酪乳桿菌、和德氏乳桿菌發(fā)酵豆?jié){的特征化合物是葉醇、仲辛酮、反-2-辛烯醛、（E，E）-2，4-庚二烯醛、3-乙基-2-甲基-1，3-己二烯、3-辛烯-2-酮、（2Z）-2-辛基-1-醇、反式-2-辛烯-1-醇；發(fā)酵乳桿菌發(fā)酵豆?jié){的特征化合物是氯甲酸正辛酯、正庚醇、（2R，3R）-（-）-2，3-丁二醇、3-羥基-2-丁酮、愈創(chuàng)木酚、苯酚；嗜熱鏈球菌兩組發(fā)酵豆?jié){中的特征揮發(fā)性氣味物質是苯酚、芳樟醇、愈創(chuàng)木酚、甲基麥芽酚、2-乙?；邕?、2-乙基己醇、異戊醇、正辛醇、苯乙醇、環(huán)庚醇、2-壬酮。與文獻[19]報道的發(fā)酵酸豆奶中的風味物質——丙酮酸、乙酸、苯甲酸等酸類物質含量較高略有差異。

3 結論

本研究結果表明：干酪乳桿菌和嗜熱鏈球菌在豆?jié){發(fā)酵過程中的產酸能力較強。5 種乳酸菌發(fā)酵豆?jié){均顯著增加了揮發(fā)性氣味物質的含量與組成，其中干酪乳桿菌、植物乳桿菌、德氏乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌4 種乳酸菌發(fā)酵豆?jié){揮發(fā)性氣味物質組成相近，與未發(fā)酵豆?jié){、嗜熱鏈球菌發(fā)酵豆?jié){間存在差異。未發(fā)酵豆?jié){的特征揮發(fā)性氣味物質是壬醛、正辛醛、戊醛、正己醛、正戊烷、反-2-辛烯醛、反，反-2，4-癸二烯醛。植物乳桿菌、干酪乳桿菌和德式乳桿菌發(fā)酵豆?jié){的特征化合物是葉醇、仲辛酮、反-2-辛烯醛、（E，E）-2，4-庚二烯醛、3-乙基-2-甲基-1，3-己二烯、3-辛烯-2-酮、（2Z）-2-辛基-1-醇、反式-2-辛烯-1-醇。發(fā)酵乳桿菌發(fā)酵豆?jié){的特征化合物是氯甲酸正辛酯、正庚醇、（2R，3R）-（-）-2，3-丁二醇、3-羥基-2-丁酮、愈創(chuàng)木酚、苯酚。嗜熱鏈球菌發(fā)酵豆?jié){的特征化合物質是苯酚、芳樟醇、愈創(chuàng)木酚、甲基麥芽酚、2-乙?；邕颉?-乙基己醇、異戊醇、正辛醇、苯乙醇、環(huán)庚醇、2-壬酮。