王新惠，孫勁松，趙 芮，潘攀，丁 悅，劉力嘉，劉 洋

（成都大學 肉類加工四川省重點實驗室 成都610106）

我國是世界最大的豬肉生產(chǎn)國和消費國[1]，主要是以熱鮮肉銷售為主，冷鮮肉和其它肉制品為輔的銷售模式，而在歐美和其他發(fā)達國家和地區(qū)，90%以上的豬肉均以冷鮮肉的形式出售。隨著經(jīng)濟發(fā)展和人們對生活品質(zhì)的提高，冷鮮肉將迎來巨大的市場潛力[2]。

由于冷鮮肉相較于冷凍肉的貯藏溫度高，細菌易滋生，因此極易腐敗變質(zhì)。家庭常用保鮮袋保存冷鮮豬肉的保質(zhì)期一般不超過5 d[3]，而市售豬肉一般未經(jīng)包裝直接置于冷柜中，保質(zhì)期可能更短。研究表明微生物是造成冷鮮肉腐敗的主要原因，并且引起不同動物肉腐敗的微生物可能不同，如假單胞菌屬（Pseudomonasspp.）和腸桿菌科細菌等在腐敗的冷藏禽類中較常見[4]。Mills 等[5]在腐敗的羊羔肉中發(fā)現(xiàn)大量的腐敗希瓦菌（Shewanella putrefaciens）、熱死環(huán)絲菌（Brochothrix thermosphacta）和梭菌屬（Clostridiumspp.）等。對于豬肉，不同部位的腐敗豬肉樣品中的菌落組成大致相同，而不同菌屬之間增長趨勢不盡相同，此外，熱死環(huán)絲菌屬在不同的樣本中含量差異較大[6]。此前對微生物進行檢測，研究微生物的主要方法有傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法、變性、溫度梯度凝膠電泳（DGGE/TGGE）等[7]。這些方法存在各種局限性，如傳統(tǒng)方法無法分離、培養(yǎng)樣品中所有的微生物，而變性、溫度梯度凝膠電泳的分辨率較低等[8]。如今出現(xiàn)的高通量測序技術（或稱第2 代測序技術）是一種高效，結(jié)果可靠的分析方法，并已廣泛應用于環(huán)境、醫(yī)學和食品等各種領域[9-10]。目前對冷鮮肉腐敗過程中細菌的群落演替規(guī)律，以及腐敗微生物與腐敗物質(zhì)之間的相關性未有深入的研究，其中冷鮮肉的腐敗問題是近幾年的研究熱點。

本研究采用16S rDNA 高通量測序方法，以非密封包裝的冷鮮肉為研究對象，對冷鮮肉腐敗過程中的細菌進行測序分析，以期錨定特定腐敗菌，分析腐敗菌與表征腐敗的指標之間的相關性，探究冷鮮肉腐敗過程中細菌群落結(jié)構(gòu)的演替過程。以期為冷鮮肉的微生物腐敗機理研究和保鮮技術的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料的準備

豬肉購自成都市十陵鎮(zhèn)久貿(mào)綜合市場。采購當天屠宰的豬腹部的五花肉，將其切成大小相近肥瘦相間的肉片，置于4 ℃冰箱貯藏。每日取樣1次，用液氮瞬間冷凍后，置于超低溫冰箱-85 ℃保存，共取樣10 次樣品編號D1 至D10 待測，每次取3 個重復樣品，結(jié)果取平均。

1.2 主要試劑和儀器

容聲冰箱BCD-221WD16NP；超低溫冰箱AP-60-395LA，艾普儀器設備有限公司；DNA 提取試劑盒E.Z.N.ATM Mag -bind Soil，美國OMEGA 公司；Applied BiosystemsRGene AmpRPCR System 9700 型PCR 儀，卓越聯(lián)合生物科技有限公司；乙醇、液氮，新金山化工有限公司；Testo 205 型肉類pH 計，維欣儀奧科技發(fā)展有限公司。

1.3 TVB-N 和pH 值的測定

根據(jù)食品安全國家標準GB 5009.228-2016中揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）的測定方法，測定豬肉中揮發(fā)性鹽基氮含量，每個時間點測3 次作為重復。豬肉的pH 值由肉類pH 計直接測定，每個樣品測3 個不同位點作為重復。

1.4 DNA 的提取和PCR 擴增及測序

參考Wang 等[11]的方法，使用E.Z.N.ATM Mag-bind Soil 試劑盒提取總DNA 后，然后使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢驗DNA 的濃度。細菌16S rDNA V4 區(qū)域擴增引物：515F（5’-GT GYCAGCMGCCGCGGTAA-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）[12]。PCR 擴增體系：每一個25 μL 的體系包括1×PCR buffer 2.5 μL、1.5 mmol/L MgCl22.5μL、0.4 μmol/L dNTPs 14.75 μL、正向和反向引物各1.5 μL，0.25 μL KODPlus-Neo 酶（TOYOBO）和2 μL 模板。PCR 程序包括起始94 ℃1 min，然后30 個循環(huán)（變性94 ℃20 s，退火54 ℃30 s 和延伸72 ℃30 s），最后72℃5 min。每個樣本進行3 個PCR 技術重復。PCR產(chǎn)物與1/6 體積的6×Loading buffer 混合，使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR 產(chǎn)物經(jīng)過純化和定量后，使用Hiseq 2500 平臺PE250 模式測序及生物信息學分析。

1.5 數(shù)據(jù)的處理

將序列進行處理得到有效數(shù)據(jù)Clean Reads后，以Usearch 軟件為基礎，利用UPARSE 算法在97%的一致性水平上進行OTU 聚類[13]，利用UCLUST 分類法和SILVA 數(shù)據(jù)庫進行注釋分析[14]。使用R 語言中Vegan 包計算Alpha 指數(shù)[15]，進行Alpha 多樣性分析。其中，Chao1 和ACE 指數(shù)表征細菌菌群的豐富度，值越大表示豐度越高。Shannon 和Simpson 指數(shù)用來表征細菌的多樣性，Shannon 指數(shù)越高代表多樣性越高。在本研究中Simpson 表示“1-Simpson's index”，其值與細菌多樣性呈正相關；Coverage 表示細菌群落的覆蓋率，其值越接近1 說明樣本中測序深度的覆蓋率越好。群落組成分析使用R 語言進行各種數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，使用ggplot2 包作圖[16]。

2 結(jié)果和討論

2.1 貯藏過程中腐敗指標變化

對貯藏過程中的冷鮮肉的揮發(fā)性鹽基氮含量和pH 值進行測定，結(jié)果如表1所示?？梢詮谋?中看出，冷鮮肉的揮發(fā)性鹽基氮含量隨著貯藏時間的增加而增加，但是貯藏的第8 天時，冷鮮肉的揮發(fā)性鹽基氮含量有所下降，可能是因為易產(chǎn)生揮發(fā)性鹽基氮的細菌如假單胞菌屬的含量減小所致。揮發(fā)性鹽基氮是評價肉類新鮮度的重要指標[17]，是微生物和內(nèi)源酶作用于肉中，從而導致蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生氨和胺類等產(chǎn)物[18]，根據(jù)GB 2707-2016 國家限量標準規(guī)定新鮮肉揮發(fā)性鹽基氮含量≤15 mg/100 g，可以從下表中看出，在貯藏的第4 天時，冷鮮肉中揮發(fā)性鹽基氮的含量已超過了國家標準。

表1 樣品的pH 值和TVB-N 含量Table 1 pH value and TVB-N content of samples

貯藏過程中，冷鮮肉的pH 值隨著時間先降低后增加，在貯藏的第4 天時，冷鮮肉的pH 值降到最低值5.69。冷鮮肉的pH 值下降主要源于被屠宰后的肌肉糖酵解產(chǎn)生乳酸和微生物酸性代謝產(chǎn)物的積累[19]，使豬肉中酸性物質(zhì)含量增加所致。而Greaser 等[20]發(fā)現(xiàn)pH 值下降的速率和糖酵解酶相關，而在低溫的環(huán)境下，酶活下降。在第5 天后，冷鮮肉中蛋白質(zhì)水解酶分解了細胞骨架蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白，導致產(chǎn)生游離氨基酸，從而使冷鮮肉的pH 值上升。

2.2 Alpha 多樣性分析

冷鮮肉貯藏過程中細菌豐度指數(shù)Chao 1 指數(shù)和ACE 指數(shù)如表2所示，可以從表中看出，細菌豐度指數(shù)隨著時間呈現(xiàn)“三級臺階” 的減小趨勢。第1 階段是在貯藏的前3 天（D1～D3），在這階段，冷鮮肉中細菌豐度有所上升，并且在D3 時，細菌的豐度達到最大值，Chao 1 指數(shù)和ACE 指數(shù)分別為1 605.84 和1 644.84；第2 階段在貯藏的D4～D6 天，細菌的豐度較第一階段有所下降；第3階段是在貯藏的D7～D10 天，最后階段時，細菌的豐度最低，在貯藏的第10 天時，冷鮮肉中的細菌菌群豐度達到最低?？梢?，冷鮮肉貯藏過程中，細菌菌群的豐度隨時間的增加而減小，主要是因為貯藏環(huán)境的溫度過低，抑制了大部分細菌的生長代謝，使增殖受到抑制。

對冷鮮肉貯藏過程中細菌菌群多樣性進行分析，從表2 中可以看出，多樣性指數(shù)Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)的變化和細菌菌群豐度指數(shù)的變化相似，也分為3 個階段。在貯藏的第3 天時，細菌菌群多樣性指數(shù)達到最大值，Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)分別為5.41 和0.98。

從表2 中可以看出，冷鮮肉中的細菌菌群的多樣性和豐度整體趨勢均隨貯藏時間的增加而降低，主要原因是大量微生物無法適應環(huán)境從而生長受到抑制。Alpha 指數(shù)的波動情況可以反映豬肉在貯藏過程中細菌群落的豐度和多樣性并不是簡單遞增或遞減，而是一個不斷變化的過程。

表2 樣品的Alpha 多樣性指數(shù)Table 2 Alpha diversity index of samples

2.3 細菌的群落結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 門水平上的細菌群落結(jié)構(gòu)分析 對所有樣本進行16S rDNA 測序，共鑒定出門、綱、目、科、屬、種共6 個水平的細菌群落結(jié)構(gòu)，本研究主要從門、目和屬的水平分析細菌群落結(jié)構(gòu)，共檢測出37 個門，181 個目，575 個屬。

如圖1所示，在門水平上對冷鮮肉貯藏過程中細菌群落結(jié)構(gòu)變化進行分析，主要有變形菌門（Proteobacteria），厚壁菌門（Firmicutes），擬桿菌門（Bacteroidetes），酸桿菌門（Acidobacteria），放線菌門（Actinobacteria）。其中變形菌門在冷鮮肉貯藏過程中屬于優(yōu)勢菌門，它在整個貯藏期的平均相對豐度占比為72.17%，在D7 占比達到最大值為93.12%。其次，厚壁菌門在冷鮮肉貯藏過程中也有較大占比，在D5、D6 和D8 中厚壁菌門的占比分別達到了25.97%，27.14%和40.28%。此外，擬桿菌門在貯藏期前3 天的占比較大，占比分別為8.31%，12.67%，15.26%，隨后逐漸減少，在貯藏第10 天時占比為1.70%。

圖1 門水平上的細菌群落結(jié)構(gòu)Fig.1 The bacterial community structure at phylum level

就整個貯藏期而言，冷鮮肉中細菌群落結(jié)構(gòu)變化情況較為復雜。在貯藏前3 天，變形菌門占比減少，而厚壁菌門和擬桿菌門占比增多。第4天變形菌門突然增多，其它細菌含量相對減少，直到第7 天擬桿菌門基本被抑制。而厚壁菌門在樣本中占比在D8 中出現(xiàn)一次較大的“反彈”，隨后在貯藏的最后2 天被變形菌門抑制。除這3 種菌門之外，其它菌門各自的平均占比不足1%。

2.3.2 目水平上的細菌群落結(jié)構(gòu)分析 樣本中細菌在目水平上的群落結(jié)構(gòu)如圖2所示，在貯藏過程中，假單胞菌目（Pseudomonadales）的平均相對豐度最高，豐度均值達40.19%，在D7 時在樣本中占比最高為59.47%，在D8 時在樣本中占比最低為22.82%。其次是腸桿菌目（Enterobacteriales），豐度均值為28.44%，最低為4.65%（樣品D6），最高為61.06%（樣品D9）。其它平均相對豐度超過1%的菌目及其平均豐度分別是芽孢桿菌目（Bacillales）8.58%，梭菌目（Clostridiales）5.85%，擬桿菌目（Bacteroidales）4.92%，鞘氨醇菌目（Chitinophagales）1.97%，乳桿菌目（Lactobacillales）1.84%，β-變形菌目（Betaproteobacteriales）1.04%。

圖2 目水平上的細菌群落結(jié)構(gòu)Fig.2 The bacterial community structure at order level

假單胞菌目作為優(yōu)勢菌目，相對豐度在貯藏期間整體趨勢為先增加，后減少；其次是腸桿菌目，在貯藏前期和后期的樣本中豐度較高，而在貯藏中期的樣本中（D5、D6）豐度較少；此外芽孢桿菌目大量存在于貯藏中、后期的樣品中，如：D5、D6 和D8。

2.3.3 屬水平上的細菌群落結(jié)構(gòu)分析 如圖3所示，在屬水平上對細菌菌群進行分析，各個樣品中平均相對豐度前10 的菌屬和它們的平均相對豐度分別是：假單胞菌屬（Pseudomonasspp.）24.77%、不動桿菌屬（Acinetobacterspp.）12.09%、泛菌屬（Pantoeaspp.）11.56%、環(huán)絲菌屬（Brochothrixspp.）7.59%、拉烏爾菌屬（Raoultellaspp.）7.53%、沙雷氏菌屬（Serratiaspp.）3.89%、嗜冷桿菌屬（Psychrobacterspp.）3.31%、腸桿菌屬（Enterobacterspp.）2.31%、乳桿菌屬（Lactobacillusspp.）1.66%和檸檬酸桿菌屬（Citrobacterspp.）1.45%，這10 種菌屬豐度之和占所有被檢測菌屬豐度的62.63%（D3）到92.10%（D7）。假單胞菌屬、不動桿菌屬、泛菌屬是整個貯藏過程中樣品中豐度較高的3 種菌屬。在貯藏過程中，假單胞菌屬是優(yōu)勢菌屬，其豐度在前期和后期都維持在25%左右，但在第4 天和第7 天出現(xiàn)較大的增加，并且在第7 天達到最大占比44.43%。不動桿菌屬在貯藏中期的樣本中（如D5、D6）含量較多，但在其它時間段，在細菌中占比較少。泛菌屬在貯藏中期（樣本D5、D5）含量較少，但是在貯藏初期和貯藏最后2 d 的含量較多。假單胞菌屬被認為是食品中最常見的與腐敗相關的菌屬，它在肉類、水果甚至飲料中均大量存在[21]。不動桿菌屬中大部分細菌為致病菌，是食品致病菌中常見的菌屬之一，在動物類食品中經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)[22-23]。有研究表明泛菌屬主要分布在土壤，人類的血液甚至糞便中[24]，研究學者發(fā)現(xiàn)在被污染和變質(zhì)的豬肉中也被檢測出有大量泛菌屬細菌。

就整個貯藏過程而言，前3 天主要的細菌菌屬為假單胞菌屬和泛菌屬，其間假單胞菌屬含量較穩(wěn)定，泛菌屬的含量在逐漸減少。貯藏的第5 至6 天，優(yōu)勢菌屬變成了不動桿菌屬，其次為假單胞菌屬和環(huán)絲菌屬。在貯藏的最后2 d，主要優(yōu)勢菌衍變成了假單胞菌屬、泛菌屬和拉烏爾菌屬。

2.4 屬水平上的細菌豐度相關性分析

冷鮮肉貯藏過程中細菌受到各種外部因素和內(nèi)部因素共同影響，以至于出現(xiàn)波動變化的情況，但細菌間的相對變化存在著相關性。通過細菌間豐度的相關性分析，可以更好地發(fā)現(xiàn)其變化的規(guī)律。在屬水平上基于細菌豐度變化的相關性分析如表3所示：假單胞菌屬與腸桿菌屬存在強相關性（r=0.92），與沙雷氏菌屬存在較強的相關性（r=0.79）；不動桿菌屬與泛菌屬（r=-0.68）、拉烏爾菌屬（r=-0.68）、沙雷氏菌屬（r=-0.66）和檸檬酸桿菌屬（r=-0.63）存在負相關性；泛菌屬的豐度與拉烏爾菌屬（r=0.99）和檸檬酸桿菌屬（r=0.98）存在強相關性，和乳桿菌屬存在負相關性（r=-0.69）；環(huán)絲菌屬與其它菌屬的相關性較弱；拉烏爾菌屬與檸檬酸桿菌屬具有強相關性（r=0.99），與乳桿菌屬（r=-0.76）和嗜冷桿菌屬（r=-0.76）呈負相關；沙雷氏菌屬與乳桿菌屬（r=-0.63）呈負相關；嗜冷桿菌屬與檸檬酸桿菌屬呈負相關（r=-0.74）；乳桿菌屬與檸檬酸桿菌屬呈負相關（r=-0.72）。

表3 各菌屬間豐度的相關性Table 3 The correlation of abundance at genus level

由相關性可以推斷腐敗的優(yōu)勢菌屬之間的變化情況，腐敗過程的主要優(yōu)勢菌屬假單胞菌屬與腸桿菌屬、沙雷氏菌屬的豐度變化情況相似；不動桿菌屬與泛菌屬、拉烏爾菌屬、沙雷氏菌屬和檸檬酸桿菌屬豐度變化情況相反；泛菌屬和拉烏爾菌屬、檸檬酸桿菌屬的變化情況相似。各菌屬之間存在著較復雜的相關性，在整個細菌群落的動態(tài)變化過程中，正相關的菌屬可能對環(huán)境的競爭力相似，兩種菌之間可能存在互生關系，如假單胞菌屬與腸桿菌屬；負相關的菌屬之間可能存在著競爭關系，如不動桿菌屬與泛菌屬。

2.5 細菌豐度與理化性質(zhì)之間的相關性

高通量測序技術不能直接實現(xiàn)微生物絕對定量（Absolute abundance）的分析，但是我們可以利用相對豐度反映某種細菌在樣品環(huán)境中的優(yōu)勢程度[25]。如表4所示，通過分析平均相對豐度前10的菌屬和pH 值與揮發(fā)性鹽基氮含量的相關性，發(fā)現(xiàn)泛菌屬，拉烏爾菌屬和檸檬酸桿菌屬的豐度與pH 值呈較強的相關性，乳桿菌屬與pH 值具有較強的負相關性；拉烏爾菌屬和檸檬酸桿菌屬與TVB-N 含量具有較強相關性，乳桿菌屬與TVB-N含量具有較強的負相關性，說明拉烏爾菌屬和檸檬酸桿菌屬可能與TVB-N 的產(chǎn)生有較大的關系。泛菌屬、拉烏爾菌屬和檸檬酸桿菌屬與pH 值相關性高，說明這些菌屬對蛋白質(zhì)的分解和堿性物質(zhì)的生成可能存在較大的關聯(lián)。含量較高的菌屬尤其是假單胞菌屬的相對豐度與pH 值、TVB-N含量的相關性不強。但在一些研究中存在不同的結(jié)論，王真真等[26]利用分離培養(yǎng)的方式測定豬肉腐敗過程中微生物數(shù)量的變化，分析微生物指標與腐敗指標的相關性，發(fā)現(xiàn)腐敗微生物數(shù)量和TVB-N、pH 值以及幾種生物胺含量之間存在強相關性。這樣的差異是由于本研究是討論豬肉樣品中細菌的相對豐度與腐敗指標變化情況的相關性，以樣品中全部細菌為研究對象，探究在腐敗過程中細菌群落的演替規(guī)律。假單胞菌屬和不動桿菌屬的相對豐度與腐敗指標不存在相關性，說明腐敗物質(zhì)的含量不是單獨由某種或某幾種豐度較高的細菌決定的，如肖香[27]的研究中指出中間耶爾森菌（Yersinia intermedia）、清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei）、屎腸球菌（Enterococcus faecium）等細菌都具有較強的蛋白質(zhì)分解能力。

表4 菌屬豐度與pH 值和TVB-N 含量的相關性Table 4 Correlation between abundances of genus，pH and TVB-N

3 結(jié)論

本研究通過高通量測序技術對冷鮮肉貯藏過程中的細菌群落結(jié)構(gòu)分析，共鑒定出37 個門，181個目，575 個屬。通過對細菌群落Alpha 多樣性的分析，發(fā)現(xiàn)冷鮮肉在貯藏前期的菌群豐度和多樣性都高于貯藏中期和后期，并且在10 d 的貯藏過程中，多樣性指數(shù)和豐度指數(shù)基本上都呈“三級臺階”式的下降趨勢。

對冷鮮肉貯藏過程中細菌群落結(jié)構(gòu)進行分析，發(fā)現(xiàn)在門水平上，優(yōu)勢菌門為變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門，其中變形菌門相對豐度最高，平均值達到72.17%，其含量在整個貯藏過程中都處于較高的水平，厚壁菌門主要出現(xiàn)在貯藏的中期，擬桿菌門主要出現(xiàn)在貯藏的前期；在目水平上，假單胞菌目的豐度最高，平均值達40.19%。假單胞菌目的相對豐度在貯藏期間呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。其次是腸桿菌目，平均豐度為28.44%，它主要在貯藏前期和后期的樣本中占比較大；在屬水平上，平均豐度前3 的菌屬分別為假單胞菌屬、不動桿菌屬和泛菌屬，貯藏前期的優(yōu)勢菌屬為假單胞菌屬和泛菌屬，中期優(yōu)勢菌屬為不動桿菌屬、假單胞菌屬和環(huán)絲菌屬，后期優(yōu)勢菌屬為假單胞菌屬、泛菌屬和拉烏爾菌屬。就整個貯藏過程而言，假單胞菌屬為腐敗的最優(yōu)勢菌屬，通過菌屬豐度之間的相關性，發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬與腸桿菌屬、沙雷氏菌屬的豐度變化情況相似。通過對菌屬的豐度和樣品TVB-N 含量和pH 值的相關性分析，發(fā)現(xiàn)拉烏爾菌屬和檸檬酸桿菌屬與TVB-N 的含量存在較強的相關性，泛菌屬、拉烏爾菌屬和檸檬酸桿菌屬的豐度與pH 值呈較強的相關性，但腐敗過程中主要優(yōu)勢菌屬假單胞菌屬和不動桿菌屬的相對豐度與腐敗指標的相關性不強，說明腐敗指標不是由某一種或某幾種優(yōu)勢菌屬單獨決定，而受到多種細菌的共同影響。