劉莉君， 章曉煒， 馬敏彪， 陸建定， 王珍珍， 盧立志， 劉雅麗*

(1.浙江省畜牧技術(shù)推廣總站，浙江 杭州 310021； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州 310021)

紹興鴨屬蛋用型品種，中心產(chǎn)區(qū)為紹興、上虞、諸暨、肖山、余姚等市(縣)，陸游的《稽山行》一詩中有“坡放萬頭鴨，園復(fù)千畦姜”之句，可見紹興養(yǎng)鴨歷史悠久。紹興鴨具有體型小、產(chǎn)蛋多、耗料少、成熟早和適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，是我國優(yōu)良的蛋用型鴨種[1]?，F(xiàn)階段，多用微衛(wèi)星手段輔助監(jiān)測(cè)動(dòng)物群體遺傳結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及遺傳物質(zhì)多樣性，從而對(duì)保種群體的穩(wěn)定性做出判斷。微衛(wèi)星是由循環(huán)序列和兩翼的保守序列構(gòu)成，核心序列的循環(huán)次數(shù)不同形成了微衛(wèi)星的高度多態(tài)性，具有分布廣、特異性強(qiáng)、易檢測(cè)等特點(diǎn)[2-4]。本研究利用微衛(wèi)星標(biāo)記分析采用各家系小群保種紹興鴨的遺傳多樣性，旨在評(píng)價(jià)該方式的保種效果，以期找到最適的保種方式，為紹興鴨資源的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血樣來源

隨機(jī)采集紹興咸亨紹鴨育種有限公司原種場(chǎng)的兩個(gè)世代30個(gè)家系的紹興鴨血液，每個(gè)世代60只個(gè)體，群體比例為1∶1，公鴨30只，母鴨30只，兩個(gè)世代共計(jì)120只。

1.1.2 主要試劑及儀器

TaKaRa Blood Genome DNA Extraction Kit試劑盒購置于寶生物工程(大連)有限公司。

一次性人體靜脈血樣采集容器(含EDTA-K2)(江蘇康捷醫(yī)療器械有限公司)；ABI3730XL全自動(dòng)DNA測(cè)序儀(ABI3730XL，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)。

1.2 方法

1.2.1 血樣采集

通過每只鴨的翅靜脈采集0.5 mL血液，置于2 mL真空采血管，-20 ℃保存。

1.2.2 DNA提取

根據(jù)TaKaRa Blood Genome DNA Extraction Kit試劑盒的說明，提取DNA。

1.2.3 微衛(wèi)星引物篩選

根據(jù)GenBank和文獻(xiàn)[5-7]提供的鴨的微衛(wèi)星序列設(shè)計(jì)引物，引物由上海捷瑞生物技術(shù)有限公司合成，并對(duì)合成的引物進(jìn)行篩選，最終選擇28對(duì)微衛(wèi)星引物(表1)。

1.2.4 PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序及反應(yīng)體系

反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性處理5 min；隨后按照94 ℃變性反應(yīng)30 s、52～64 ℃退火35 s、72 ℃延伸40 s 3步進(jìn)行35個(gè)擴(kuò)增循環(huán)；最后在72 ℃繼續(xù)延伸10 min。

反應(yīng)體系：DNA 2 μL，l0×Taq Buffer 2 μL，TaqDNA聚合酶0.2 μL，0.2 mmol·L-1dNTP 0.2 μL，上下游引物(5 pmol·L-1)各1 μL，ddH2O補(bǔ)齊至20 μL。

1.2.5 PCR產(chǎn)物檢測(cè)

利用ABI 3730XL測(cè)序儀通過毛細(xì)管電泳，檢測(cè)PCR產(chǎn)物片段大小?？倻y(cè)序含量為10 μL，包括高質(zhì)量去離子甲酞胺Hi-Di Formamide 7.5 μL，引物(表1)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2 μL和GS-500 SizeStandard(標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參)0.5 μL。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用GeneMaker 2.6.0軟件讀出各座位各目標(biāo)片段大小，判斷純合子或雜合子(單峰和雙峰)；采用Microsatellite-Toolkit軟件對(duì)群體遺傳多樣性參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；采用Popgene 32軟件對(duì)所檢測(cè)座位的哈代-溫伯格平衡、Nei氏遺傳距離及相似性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；兩個(gè)世代的所有數(shù)據(jù)通過SPSS 17.0軟件分析差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 微衛(wèi)星座位檢測(cè)分型

經(jīng)ABI3730XL DNA Analyzer全自動(dòng)測(cè)序儀對(duì)28個(gè)座位進(jìn)行檢測(cè)掃描，由GeneMaker 2.6.0自動(dòng)生成圖譜，圖1為其中一個(gè)座位的基因型。

圖1 某座位的基因分型

2.2 等位基因比較

經(jīng)過一個(gè)世代的保種，等位基因數(shù)基本保持不變(表2)，兩個(gè)世代各微衛(wèi)星基因座位的平均等位基因(P=0.965)和優(yōu)勢(shì)等位基因頻率(P=0.538)差異均不顯著。

表2 兩個(gè)世代群體等位基因數(shù)、優(yōu)勢(shì)基因片段大小及頻率

2.3 基因座位遺傳多態(tài)性比較

兩個(gè)世代群體各微衛(wèi)星座位遺傳多態(tài)性見表3。兩個(gè)世代的多態(tài)信息含量值(PIC)為0.184 2～0.846 2，其中APH14和CMO12兩個(gè)座位為低度多態(tài)(PIC<0.25)，其他座位為中高度多態(tài)(PIC>0.25)；兩個(gè)世代群體PIC平均值分別為0.483 2和0.479 3，差異不顯著(P=0.703)；He值(期望雜合度)在0.208 4～0.868 2，平均值分別為0.502 8和0.513 8，兩個(gè)世代無顯著差異(P=0.482)；Ho值(表觀雜合度)在0.172 9～0.964 8，兩個(gè)世代平均值分別為0.650 0和0.639 3，差異不顯著(P=0.903)。

表3 兩個(gè)世代在28個(gè)基因座位遺傳多態(tài)性

2.4 遺傳變異檢測(cè)

通過對(duì)兩個(gè)世代每個(gè)座位的哈代-溫伯格的檢驗(yàn)(表4)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，27世代有7個(gè)不平衡座位，28世代有8個(gè)不平衡座位。從表5可以看出，兩個(gè)世代間Nei氏相似性系數(shù)為0.991 5，Nei氏遺傳距離為0.008 5，Nei氏相似性系數(shù)極高且遺傳距離極低，符合保種群世代間遺傳規(guī)律。

表4 兩世代28個(gè)基因座位的哈代-溫伯格檢驗(yàn)

表5 兩個(gè)世代的Nei氏遺傳距離及相似性系數(shù)

2.5 群體有效含量檢測(cè)

該保種場(chǎng)采用小群體隨機(jī)留種保種方法，保種群約550只(母鴨500只，公鴨50只)，按照公式Ne=4 Ns·Nd/Ns﹢Nd計(jì)算得出該保種場(chǎng)群體有效數(shù)量(Ne)為182只，每代近交增量(ΔF)為0.27%，近交系數(shù)達(dá)到5%需要19個(gè)世代。

3 小結(jié)與討論

有效等位基因、雜合度(H)、多態(tài)信息含量(PIC)均是反映品種內(nèi)遺傳變異大小的量度[8]。遺傳多樣性的雜合度指標(biāo)可以反映各群體在多個(gè)座位上的遺傳變異，Takezaki等[9]認(rèn)為，用于測(cè)定遺傳差異的標(biāo)記在群體中的平均雜合度在0.3～0.8才有實(shí)際意義。多態(tài)信息含量是檢測(cè)等位基因變異程度高低的主要指標(biāo)之一，當(dāng)PIC>0.5時(shí)，為高度多態(tài)性，當(dāng)0.25

本研究利用28個(gè)微衛(wèi)星座位分析了紹興鴨小群保種的兩個(gè)世代群體遺傳多樣性及保種效果，結(jié)果顯示，在分子水平指標(biāo)均無顯著性變化。其中，兩世代的He平均值分別為0.502 8和0.513 8，Ho平均值分別為0.650 0和0.639 3，均在0.3～0.8，兩個(gè)世代的APH14和CMO12座位表現(xiàn)為低度多態(tài)，其余座位表現(xiàn)為中高度多態(tài)(PIC>0.25)。兩世代PIC平均值分別為0.483 2和0.479 3，處于中度多態(tài)。通過一個(gè)世代更替，等位基因數(shù)略有上升，兩世代平均等位基因和優(yōu)勢(shì)等位基因頻率差異均不顯著。

哈代-溫伯格檢驗(yàn)和群體有效數(shù)量也是反映群體遺傳穩(wěn)定性的重要指標(biāo)。本研究的兩個(gè)世代紹興鴨28個(gè)微衛(wèi)星座位中分別有7和8個(gè)座位處于不平衡狀態(tài)，低于張靜等[11]的18個(gè)微衛(wèi)星基座中有14個(gè)座位處于不平衡狀態(tài)，但依舊表明該保種群遺傳結(jié)構(gòu)逐漸趨于不平衡狀態(tài)，主要原因可能是各家系小群保種采用輪配方式導(dǎo)致隨機(jī)性變小而引起的遺傳漂變，因此，保種場(chǎng)可以擴(kuò)大各家系保種數(shù)量，同時(shí)增加群體保種的方式來提高群體遺傳穩(wěn)定性。該保種場(chǎng)目前的有效保種群體數(shù)量(Ne)為182只，世代的ΔF為0.27%，符合世代增量低于0.50%的原則，表明小群保種能夠有效的保存紹興鴨的品種特征，對(duì)水禽采用這種保種方法是可行的，可以作為監(jiān)管部門保種監(jiān)測(cè)的輔助手段。