石穎， FAISAL Islam， 周偉軍， 王尖

(1.浙江大學 農業(yè)與生物技術學院，浙江 杭州 310058； 2.浙江省農業(yè)科學院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

雜草是適應作物氣候條件、農耕制度、栽培方式等生態(tài)環(huán)境而生存的植物[1]，它們與作物爭奪光照、肥料、空間，影響其光合作用，阻礙生長，嚴重危及糧食生產的安全與穩(wěn)定。雜草是影響作物產量的重要因素之一，應用化學除草劑防除雜草是一項重要的技術措施。而激素類除草劑由于其具有高選擇性、廣譜性、效果好及低成本的特性，在世界范圍內大量使用的歷史已超過60 a[1]。其中2,4-D即2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，2,4-D)，是一種廣泛使用的苗前/后激素類內吸選擇性除草劑，對植物有相當強的選擇作用。2,4-D對大多數闊葉類雜草具有顯著防除效果，同時在水中具有極好的溶解性，能夠使有效成分在植物葉片和根中迅速傳遞，截止目前仍在世界各地的雜草防除中起著重要作用[2]。2,4-D能夠模擬植物內源激素調節(jié)植物生長，促進細胞分裂和增長，低濃度下能夠增加結實率[3]。本文通過全面地歸納總結2,4-D對作物與生態(tài)環(huán)境的影響及使用情況，探究2,4-D在環(huán)境中的傳播途徑和分布，為2,4-D更好、更安全地使用提供借鑒，同時為今后除草劑篩選及合理使用提出新的思考。

1 2,4-D在自然環(huán)境中的分布與存在形態(tài)

純的2,4-D在水中的溶解度低，僅微溶于水。因此，生產上常用的制劑一般可以分成胺鹽、脂類和膽堿鹽等[4]。2,4-D的降解時間根據環(huán)境的不同大約在20 d到312 d之間不等[5]。由于2,4-D的低吸附系數和高水溶性，在地表和地下水中都能檢測到2,4-D的存在。2,4-D在自然環(huán)境中的分布如表1所示，2,4-D已廣泛存在于食物、空氣、水體中，并對人類健康造成不同程度的危害。

表1 2,4-D的分布和含量

2 2,4-D的代謝和降解

2,4-D在土壤中的降解是一個逐漸衰減的過程，同時也受生物和非生物環(huán)境的影響。通常情況下，2,4-D能夠在生物和非生物的互相作用下在處理后的幾天之內降解，但仍有2%的2,4-D會殘留在土壤中，如果殘存超過9個月就會影響對2,4-D敏感的后茬作物。2,4-D殘留的原因可能是土壤中缺乏能夠代謝2,4-D的微生物或者微生物數量太少。表2列舉了近些年研究證實有代謝2,4-D潛力的微生物菌株。微生物降解2,4-D主要通過兩條代謝途徑[13]：在α-酮戊二酸依賴型雙加氧酶TfdA(來自富養(yǎng)產堿菌JMP134)或CadABC(來自短根瘤菌HW13)的作用下，催化2,4-D脫去乙酸基團生成毒性比2,4-D低100倍的2,4-二氯苯酚，隨后2,4-二氯苯酚在羥化酶TfdB的催化下被轉化為3,5-二氯鄰苯二酚，隨后在TfdCDEF的作用下開環(huán)，最終被降解為β-酮己二酸，進入三羧酸循環(huán)[14]；在圓褐固氮菌(Azotobacterchroococcum)中，2,4-D在未知脫氯酶的作用下首先脫去一個氯原子生成對氯苯氧乙酸，隨后氧化脫去乙酸基團生成對氯苯酚，進一步羥基化生成4-氯鄰苯二酚，然后開環(huán)被降解為β-酮己二酸，最終進入三羧酸循環(huán)[15]。

表2 降解2,4-D的潛力微生物菌株

在植物中，2,4-D的代謝途徑包括側鏈裂解、環(huán)羥基化、共軛作用、結合生成植物生化基質[24]。側鏈裂解是側鏈經過氧化作用生成乙醇酸和二氯苯酚，同時導致二氧化碳含量減少。共軛反應主要是指2,4-D與氨基酸或葡萄糖的直接結合[25]。氨基酸(主要是谷氨酸和天冬氨酸)和葡萄糖可與2,4-D的羧酸基團直接結合，生成氨基酸軛合物或2,4-D葡萄糖酯。氨基酸軛合物是雙子葉植物中形成的第一代謝產物，最初產生谷氨酸軛合物，但隨著時間的推移，2,4-D-谷氨酸軛合物轉化為其他代謝物，如2,4-D-天冬氨酸軛合物和糖軛合物，2,4-D-葡萄糖軛合物在葡糖基轉移酶的作用下生成葡萄糖酯[26]。環(huán)羥基化則主要發(fā)生在抗性的單子葉植物。細胞色素P450酶參與了環(huán)羥基化，催化2,4-D代謝為4-羥基-2,5-二氯苯氧基乙酸和4-羥基-2,3-二氯苯氧基乙酸。羥基化后，葡萄糖基轉移酶迅速催化環(huán)羥基化代謝物生成O-葡萄糖苷，接著代謝產物進一步和其他糖(包括丙二酸)形成更大的結構。環(huán)羥基化后的產物和2,4-D相比具有更強的親水性和極性，同時也不像結合的產物一樣能夠水解還原成為2,4-D[27]。

3 2,4-D對生物體的危害及與環(huán)境的互作

除草劑能夠通過直接接觸、間接積累來影響生物產生逆境響應。很多研究已表明在除草劑噴施后生物體能夠在非常短的時間內積累一個相當高的2,4-D濃度[28]。例如，在稻田水中檢測到的2,4-D濃度超過300 μm·L-1，而在土壤中的含量高于0.17 mg·kg-1[29]。水體污染經常是由農藥的過量噴施和漂移引起的。數十年的研究發(fā)現水生食物網在受到2,4-D污染后會將除草劑殘留釋放進入海洋環(huán)境并逐步在海洋環(huán)境中大量積累，最終通過動物的飼養(yǎng)進入人體[30]。

3.1 2,4-D對植物的危害

雖然使用化學除草劑是很有效的除草方法，但是非選擇性的除草劑仍然會對植物造成傷害。2,4-D作為人工合成的類生長激素主要作用于生長激素受體TIR1或者它的類似物，增強生長激素響應基因的表達，特別是涉及乙烯和脫落酸合成的基因[31-32]。在敏感型雙子葉或者靶標植物中，2,4-D引起的生理響應大致可以分為刺激、抑制和衰退3個階段[32]。刺激階段在幾分鐘內就開始發(fā)生，伴隨內源生長激素濃度的迅猛上升，同時乙烯、脫落酸含量增加，離子通道和ATP酶代謝被激活，幾小時后植物呈現出偏上性生長、組織膨大、莖扭曲等明顯的異常癥狀。在抑制階段，大量活性氧的產生導致氣孔關閉，誘導生理防御和脅迫響應，減少氨基酸、糖類、核酸和其他初級代謝物等植物生長發(fā)育必需物質的總產量。這些大量不受控制的反應導致了生長停滯并最終走向衰退的階段。大約3 d后，葉綠體、膜、維管束系統(tǒng)的崩潰使組織/細胞受到嚴重損傷最終導致植物死亡。雖然2,4-D選擇性的防除闊葉類雜草，但由于它對植物的毒性已對很多敏感的闊葉類作物產生了危害。研究發(fā)現，棉花、大豆和葡萄等闊葉類作物，在極低濃度的2,4-D作用下就可造成嚴重減產。當葡萄葉子接觸2,4-D，會對內部和外部的組織細胞產生嚴重的異常癥狀，保衛(wèi)細胞失活，光合作用和蒸騰作用降低，最后導致植株死亡[33]。2,4-D接觸過的棉花葉片和莖受損嚴重，產量和對照相比顯著降低35%[34]?；ㄉ?,4-D處理后的1～2周后，藥害癥狀和除草劑濃度相關，濃度越高毒害越嚴重，產量也越低[35]。其他蔬菜作物對低劑量2,4-D的敏感性各異。

3.2 2,4-D對野生動物的危害

野生動物接觸2,4-D，不管是直接噴灑還是攝入噴施過的植物都是低毒?，F在研究證明，2,4-D對魚類、兩棲類(青蛙)實際無毒，對水生無脊柱動物僅有輕微毒性，對蜜蜂和蚯蚓實際無毒。但是Dehnert等[36]和Thiel等[37]發(fā)現，2,4-D會改變幼魚視覺神經回路的發(fā)育和功能，影響成年斑馬魚線粒體的功能和氧化狀態(tài)。2,4-D通過吸收、攝取或皮膚進入哺乳動物體內，毒性表現比較溫和，LD50的范圍是209 mg·kg-1(日本鵪鶉)～1 600 mg·kg-1(兔子)[38]。對昆蟲(瓢蟲)成蟲來說，2,4-D雖然不會致死，但會影響幼蟲的生育期和存活率，還能降低雄性比例[39]。

3.3 2,4-D對人類的危害

農業(yè)用地、商業(yè)和住宅綠地、高爾夫球場、公園、路旁等地都是人類可能通過吸入(灰塵/蒸汽)、非飲食攝入或者皮膚接觸等方式接觸2,4-D的潛在區(qū)域，同時被2,4-D污染的飲用水、土壤和食物則是接觸2,4-D的主要途徑。2,4-D污染的空氣能夠引起皮膚和肺部的刺激、發(fā)癢和灼燒感，直接攝入則會導致嘔吐、頭疼、腹瀉、骨肌受損、高血壓等[40]。人類可以通過尿液的排泄有效迅速地代謝2,4-D[41]。通常來說，成人和孩子尿液中的2,4-D含量低于3.5 ng·mL-1(美國和加拿大)[42-43]，然而職業(yè)工人噴施2,4-D前后尿液中的含量分別是7.8 μg·L-1和33 μg·L-1[44]。最近的流行病學研究表明，玉米地的農民在噴施2,4-D后尿液中的除草劑含量是對照組的5倍，并且2,4-D會引起DNA的損傷和脂蛋白的過氧化。這可能表明2,4-D誘導的氧化反應在癌癥和其他慢性疾病的發(fā)病機理中起重要作用[45]。雖然很多哺乳動物的毒理學研究表明接觸2,4-D能夠引起動物和人類的不良反應，但是2,4-D誘導的毒性機理還不清楚。短時間的接觸2,4-D會嚴重影響細胞功能，在分子水平上2,4-D阻礙細胞骨架和產生活性氧來影響肺中的細胞微管系統(tǒng)，導致呼吸困難、咳嗽、胸痛，最終形成肺氣腫或者慢性的肺部疾病[40]。2,4-D還能和牛血清蛋白結合形成復合物，蛋白的內源熒光被猝滅，同時伴隨著蛋白構象的改變[46]。另一個令人震驚的結果是2,4-D能夠協(xié)同其他污染物質一起產生不良的誘變反應，例如它能夠和其他污染物質一起作用于結腸腺癌細胞，產生更加嚴重的反應[47]。Sun等[48]發(fā)現，2,4-D通過調控過氧化物酶體增殖活化受體影響肝癌細胞的葡萄糖代謝，導致其代謝紊亂。

3.4 2,4-D和環(huán)境的互作

地表水中的除草劑最終會沉積到底渣中，可能對底棲生物產生影響。如果環(huán)境條件發(fā)生變化，吸附的除草劑可以釋放回環(huán)境介質中。土壤是一種動態(tài)的生態(tài)系統(tǒng)，其中除草劑可以降解或改變位置，或者在原位保留完整的初始結構，或者在一定的時間段內或多或少地分解[49]。在穩(wěn)定的環(huán)境條件下，除草劑會變得更具流動性和持久性，從而進入地下水循環(huán)系統(tǒng)。在小麥種植中，2,4-D表現出更高深度的滲透率，這歸因于土壤中水含量較高，同時2,4-D具有水溶性和對土壤顆粒的低吸附性。土壤中2,4-D的軌跡受多種復雜的動態(tài)物理、化學和生物過程控制，包括揮發(fā)、吸附-解吸、化學和生物降解、植物吸收、徑流和淋溶[50]。所有這些過程都取決于2,4-D的物理化學性質、環(huán)境條件、微生物和土壤性質。這些因素直接控制土壤溶液中2,4-D的濃度、遷移、土壤耗散、淋溶及植物對其的生物利用度。另外，2,4-D作為弱酸會失去質子，因此，它主要作為陰離子存在土壤(pH 5～8)中。通常，陰離子很難被土壤表面吸附。2,4-D與土壤的結合能力很弱，并且與土壤pH值升高呈負相關。2,4-D吸附隨著土壤有機質的增加而增加，如果土壤中黏土或有機質含量低，則淋溶是2,4-D脫靶運動的主要來源。在灌溉條件下，淺層土壤的地下水中2,4-D含量較高。

4 2,4-D的使用現狀

2,4-D在全球范圍內被廣泛用于控制小粒谷物、水果、堅果、蔬菜、作物、牧場、草坪、道路、水域和林區(qū)中的闊葉類雜草和木本植物。目前在美國登記的2,4-D產品和2,4-D混劑都超過50種。在1945—1959年，2,4-D的產量從41.6萬kg上升到了635萬kg[51]。隨著新型選擇性除草劑的開發(fā)，2,4-D在美國主要作物上的用量從1966年的1 810萬kg(占除草劑用量的34%)，下降為1971年的1 540萬kg(占除草劑用量的15%)[52]。然而1960—1971年，2,4-D占小麥田農藥用量的大半，甚至在20世紀90年代初期，仍有40%～60%的春小麥和硬粒小麥、15%～20%的冬小麥、10%的玉米、9%的高粱在種植過程中使用2,4-D。截至2012年，13%的冬小麥2,4-D的平均用量為600 g·hm-2，有效成分總計近110萬kg[41]。國內生產的2,4-D產品主要是丁酯類，2012年我國含2,4-D丁酯成分除草劑的年生產量26 117 t，國內銷售20 841 t，農業(yè)生產使用19 887 t。根據農業(yè)部農藥檢定所統(tǒng)計，我國已有6家企業(yè)登記原藥，43家企業(yè)登記單劑，122家企業(yè)登記復配劑。劑型有乳油、懸浮劑、水懸浮劑、可分散油懸浮劑等，按有效成分計算，年生產量近3萬t，待開發(fā)的轉基因耐除草劑的應用，2,4-D丁酯也是主要品種，應用非常廣泛。

另一方面，由于2,4-D擁有類似自然激素的特性，低濃度的2,4-D也可以作為生長調節(jié)劑增加細胞分裂和伸長，提高植物長勢。2,4-D能夠使細胞黏彈性發(fā)生變化，影響細胞內物質運輸速度[53]。2 mg·L-1的2,4-D可以加快球花紅假單胞菌的生長和脂肪積累[54]。2,4-D通過誘導赤霉素合成來促進梨的單性結實[55]。在組織培養(yǎng)中，2,4-D能代替生長素(IAA)作為植物細胞培養(yǎng)基中正常細胞生長發(fā)育的激素補充。但Passamani等[56]和Reis等[57]發(fā)現，長期使用2,4-D會降低甘蔗胚性愈傷組織的胚性能力。2,4-D還能作為一種強力的水稻防御誘導因子。食草動物取食植物會激發(fā)各種激素包括茉莉酸、水楊酸、乙烯的防御響應。而2,4-D顯著誘導茉莉酸和乙烯的上游通路的防御反應，增強胰蛋白酶抑制劑的活性和揮發(fā)性物質的產生。在田間試驗中，水稻噴施2,4-D能吸引褐飛虱和它的卵寄生物種稻虱纓小蜂[58]。2,4-D通過調節(jié)抗氧化防御的酶活性降低氧化脅迫，提高單子葉植物對鹽害逆境耐受能力[59]。

5 雜草對2,4-D的抗性

2,4-D自1946年商業(yè)化投入使用以來，憑借著高效的除草能力和低廉的成本至今仍是世界范圍內使用最廣泛的除草劑之一，目前市場上有超過600種的2,4-D產品。由于使用時間太久、噴施量太大導致雜草對其產生了不同程度的抗性。盡管2,4-D的使用歷史超過70 a，它在靶標雜草中對除草劑抗性演變的影響仍然有限。目前已報道31種雜草具有抗生長激素型除草劑的生物型，而僅使用30 a的乙酰乳酸合酶(ALS)抑制類除草劑產生了158種抗性雜草[60]。但是隨著北美轉基因抗2,4-D作物的商業(yè)化種植，抗性雜草的種類可能會迅速增加，同時加快抗性雜草的進化速度[61]。

5.1 雙子葉雜草對2,4-D的抗性

到目前為止，已經有40例雜草對生長激素類除草劑產生抗性的報道，其中有25例對2,4-D有抗性，包括僅對2,4-D有抗性的12例和對其他生長激素型除草劑也有抗性的13例[62]。這25例中有22例涉及雙子葉雜草，其中野蘿卜(Raphanusraphanistrum)、野胡蘿卜(Daucuscarota)、黃花藺(Limnocarisflava)、虞美人(Papaverrhoeas)和尖瓣花(Sphenocleazeylanica)以及兩種飛廉屬(Carduus)雜草等具有多個抗性案例[62]。自2011年Mithila[63]等人報道了激素類除草劑抗性之后，最新發(fā)現的糙果莧(Amaranthustuberculatus)[64]、野蘿卜的其他幾個種群[65-66]、播娘蒿(Descurainiasophia)以及一年生苦苣菜(Sonchrusoleraceus)種群等對2,4-D類似物苯氧乙酸類除草劑2甲4氯(MCPA)具有抗性。最近的遺傳研究探明西澳大利亞洲野蘿卜對MCPA的抗性受單一不完全顯性基因的控制[67]。

5.2 抗性的機理

Transport Inhibitor Response 1(TIR1)和Auxin F-Box(AFB)是激素類除草劑中2個最重要的靶標位點[68]。之前的基因組學和蛋白免疫沉淀實驗的結果顯示，內源激素IAA能夠激活TIR1或者它的底物Aux/IAA蛋白[69]。Dharmasiri等[70]研究發(fā)現，F-box蛋白在配體結合中起到關鍵作用。而隨后的蛋白晶體結構學又顯示被激活的TIR1復合體是受體結合的一種新的形式，像一種“分子膠”，同時參與底物的結合來形成早期的識別口袋。雖然晶體結構學顯示起主要作用的是激素和TIR1的結合，但是TIR1以及它的底物Aux/IAA蛋白在配體結合中都是不可或缺的[71]。在擬南芥中，TIR1家族有AFB1、AFB2、AFB3、AFB4和AFB5這5個同源蛋白。其中，AFB4、AFB5均為除草劑毒莠定的作用受體，這5個蛋白共同作用，調控生長素反應[72]。最近的研究表明，擬南芥中TIR1輔助受體富含亮氨酸的重復結構域中2個不同氨基酸的突變增加了對IAA的結合親和力，導致了Aux/IAA轉錄抑制子的降解加快和生長素響應基因的轉錄增加[73]。這些突變被認為是造成典型的生長素超敏癥狀的原因。另外，2個TIR1的突變是加性效應，使得雙突變的TIR1蛋白比單一突變具有更高的親和力[74]，這與毒秀定和AFB結合不同。這些結果表明擬南芥或其他雙子葉植物的TIR1/AFB蛋白修飾，可增加或降低這些蛋白對2,4-D或其他合成類除草劑的結合力，導致植物出現生長素超敏反應或者脫敏反應[75]。除此之外，發(fā)生在Aux/IAA轉錄抑制子蛋白的突變也會影響其與生長素受體TIR1/AFB家族的結合與相互作用[73]。

除去靶標位點可能產生的突變，另一種可能就是細胞色素P450s或者谷胱甘肽S轉移酶(GSTs)等產生的非靶標抗性，包括除草劑代謝增強、運輸減少[76]。例如，抗性的野萵苣和敏感的品種相比，2,4-D的代謝速率沒有差異，但是吸收和運輸顯著上升[77]。這可能是由于除草劑代謝第3階段的運輸和解毒能力，極性代謝物和除草劑的結合物在液泡中永久被固定[78]。

6 展望

2,4-D從開發(fā)到如今已經超過70 a，一直作為各種作物和非作物用途中的雜草防除工具。對2,4-D化學、生理、作用機制、環(huán)境行為等方面的研究不僅有助于闡明其自身的特性，為除草劑作用機制和生理學研究奠定基礎，還對其后新穎除草劑的研發(fā)具有重要的借鑒意義。近年來，隨著對分子水平作用機制的深入研究，借助生物技術手段發(fā)展了2,4-D的新用途，延長了使用壽命，使其能更好地繼續(xù)為人類生產和生活服務。