杜 娜 , 張 敏, 吳志昊 焦 爽 尤 鋒 譚訓(xùn)剛

(1. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所 中國(guó)科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心, 中國(guó)科學(xué)院 實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東省實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071; 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室 海洋生物與生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266237; 3. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049; 4. 青島科技大學(xué), 山東 青島266061)

細(xì)胞決定、生長(zhǎng)發(fā)育、分化、繁殖、細(xì)胞癌變及凋亡等生化途徑都與基因的表達(dá)模式息息相關(guān)。具有靈敏度高、動(dòng)態(tài)變化范圍大、高通量且精確定量的實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)被應(yīng)用于檢測(cè)基因表達(dá)水平變化的研究中[1], 包括相對(duì)定量和絕對(duì)定量?jī)煞N方法, 其中應(yīng)用最為廣泛的是相對(duì)定量方法。但是該方法受到多種因素的影響[2-3], 其中一個(gè)重要的因素就是相對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量方法中的內(nèi)源參考基因或管家基因的選擇。由于相對(duì)定量是將目的基因表達(dá)水平與標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參基因相比較, 這就要求所選取內(nèi)源參比基因在生物的不同生長(zhǎng)過(guò)程及不同組織間具有盡可能小的變化。

多倍體誘導(dǎo)是一種產(chǎn)生新基因型的育種方法。當(dāng)生物被誘導(dǎo)成多倍體時(shí), 其基因組的數(shù)量和結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化, 并導(dǎo)致某些基因的表達(dá)水平發(fā)生改變[4]、轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控和翻譯后修飾的改變, 這些都可能引起基因過(guò)表達(dá)或基因沉默, 結(jié)果導(dǎo)致生物表型改變[5]。一些研究表明, 在某些三倍體魚(yú)類(lèi)中, 其基因表達(dá)水平降低到二倍體的狀態(tài), 這種現(xiàn)象稱為劑量補(bǔ)償效應(yīng)[6]。除此之外, 在三倍體雜交魚(yú)種中還出現(xiàn)不完全顯性的效應(yīng)[6,7], 即三倍體生物中等位基因的表達(dá)模式與其二倍體個(gè)體不同, 包括同一基因在二、三倍體個(gè)體間的表達(dá)差異, 以及同一個(gè)基因在不同組織之間的表達(dá)差異。在三倍體鯊魚(yú)(Squalius alburnoides)的性腺中,vasa、β-肌動(dòng)蛋白基因(β-actin)、核糖體蛋白L8基因(rpl8)和3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(gapdh)的表達(dá)僅來(lái)自于一套基因組[8], 而在三倍體鯽魚(yú)(Carassius auratus)中, 由于劑量補(bǔ)償?shù)挠绊?管家基因β-肌動(dòng)蛋白的絕對(duì)表達(dá)量與二倍體相等[9]。這表明染色體加倍后, 無(wú)論是組織特異性基因還是管家基因的表達(dá)水平相比二倍體都可能發(fā)生變化。因此, 在多倍體的相關(guān)研究中需要篩選合適的內(nèi)源參比基因, 才能準(zhǔn)確檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)水平的變化。

牙鲆(Paralichthys olivaceus)是中國(guó)北方、韓國(guó)和日本沿海地區(qū)重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)。不同的研究對(duì)于二、三倍體牙鲆生長(zhǎng)性狀的優(yōu)勢(shì)分析并不相同, 這種現(xiàn)象是否由基因補(bǔ)償效應(yīng)等機(jī)制引起的并不明確。要探究牙鲆三倍體與二倍體之間的差異表達(dá)基因, 就必須篩選合適的參比基因來(lái)對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正, 從而使結(jié)果更可靠。已知18S核糖體RNA(18S rRNA)被認(rèn)為是表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定的基因,而且在二倍體牙鲆胚胎發(fā)育過(guò)程的不同階段表達(dá)水平相對(duì)穩(wěn)定[10]。因此, 在本實(shí)驗(yàn)中, 作者先測(cè)定18S rRNA的變化, 再以它為參考對(duì)其他廣泛使用的7個(gè)候選參考基因進(jìn)行了定量鑒定: β-肌動(dòng)蛋白基因(β-actin)、β-2-微球蛋白基因(b2m)、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(gapdh)、核糖體蛋白L17基因(rpl17)、α-微管蛋白基因(α-tub)、延伸因子-1-α基因(ef1-α)、泛素結(jié)合酶基因(ubc-e)。通過(guò)分析這些基因在牙鲆二、三倍體的肌肉和腦組織中表達(dá)量及在個(gè)體和倍性之間的穩(wěn)定性, 以獲得較合適的內(nèi)源參比基因, 用于分析組織和器官發(fā)育相關(guān)基因在牙鲆二倍體和三倍體中表達(dá)的差異, 從而探究染色體加倍對(duì)組織和器官發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 樣品

樣品采集于中國(guó)科學(xué)院海洋研究所養(yǎng)殖的幼魚(yú),二倍體和三倍體牙鲆各3條, 其中二倍體牙鲆的體質(zhì)量分別是95.5、101、91 g, 三倍體牙鲆的體質(zhì)量分別是63.5、65.5、54 g。麻醉后采集肌肉和腦于200 μL Trizol(Invitrogen, 美國(guó))中, 并在-80 ℃冰箱保存直至使用。

1.2 總RNA提取

按照Trizol試劑使用說(shuō)明提取樣品的總RNA。提取后, 用Thermo NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度, 使用普通瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。

1.3 定量PCR

按照 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Takara, 日本)試劑盒的說(shuō)明書(shū)合成cDNA第一鏈, 作為定量PCR的模板。按照SYBR?Premix Ex Taq?II (Tli RNaseH Plus)試劑盒說(shuō)明書(shū)配置定量PCR反應(yīng)體系, 使用Applied Biosystems 7300 Fast Real-Time PCR擴(kuò)增儀(Life Technologies, 美國(guó))進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件采用兩步法, 程序是95 ℃變性 30 s;然后是95 ℃變性 5 s, 60 ℃退火20 s, 35個(gè)循環(huán)。所有的樣品同時(shí)重復(fù)3次, 取Ct均值。

根據(jù)ZHONG等[10]的結(jié)果, 作者對(duì)18S rRNA采用絕對(duì)定量方法進(jìn)行, 先擴(kuò)增18S rRNA的基因組片段(引物為18S rRNA-G-F 和 18S rRNA-G-R)(表1)。將PCR所得片段連接到Peasy-T3 載體 (全式金生物技術(shù)有限公司), 通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證獲得帶有正確片段的質(zhì)粒。利用去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒(康為世紀(jì)生物科技有限公司)提取質(zhì)粒。用Thermo NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)測(cè)量濃度, 然后按照一定的比例(5×101～5×108)稀釋作為模板進(jìn)行qPCR反應(yīng)。以質(zhì)?？截悢?shù)為橫坐標(biāo), Ct值為縱坐標(biāo), 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以獲得的各個(gè)組織cDNA為模板, 進(jìn)行qPCR反應(yīng), 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線以及測(cè)得的胚胎樣品Ct值, 可計(jì)算得到樣品的18S rRNA拷貝數(shù), 以二倍體的表達(dá)量做為基準(zhǔn)折算出倍數(shù)。

表1 基因組克隆引物和基因?qū)崟r(shí)定量PCR所用引物Tab. 1 Primers for genomic cloning and real-time quantitative PCR

續(xù)表

而對(duì)于其他β-肌動(dòng)蛋白基因(β-actin)、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(gapdh)、核糖體蛋白L17基因(rpl17)、α-微管蛋白基因(α-tub)、延伸因子-1-α基因(ef1-α)、β-2-微球蛋白基因(b2m)和泛素結(jié)合酶基因(ubc-e) 等7個(gè)基因(引物見(jiàn)表1), 則以18S rRNA為內(nèi)參基因, 以相對(duì)定量PCR方法, 用2-ΔΔCt法計(jì)算其相對(duì)于18S rRNA表達(dá)量的倍數(shù), 再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及各自18S rRNA的Ct值計(jì)算得到的18S rRNA拷貝數(shù), 折算出各自的絕對(duì)拷貝數(shù), 最后再以二倍體組織的表達(dá)量作為基準(zhǔn)折算出倍數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

除了絕對(duì)定量分析表達(dá)倍數(shù)的方法, 還參考ZHONG等[10]和LIVAK 等[11]的方法, 利用2-ΔCt方法進(jìn)行表達(dá)倍數(shù)的計(jì)算, 這兩種分析方法的數(shù)據(jù)采用Graph Pad Prism 6.01進(jìn)行作圖, 并利用t檢驗(yàn) (unpairedt-test)分析不同倍性之間基因表達(dá)的差異及單因素方差分析基因表達(dá)的穩(wěn)定性(one way ANOVA);另外, 還通過(guò)NormFinder[12]方法分析基因表達(dá)穩(wěn)定性, 以獲取最優(yōu)的內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 牙鲆二倍體和三倍體肌肉和腦中18S rRNA的表達(dá)

作者對(duì)牙鲆二倍體和三倍體的肌肉和腦中的18S rRNA進(jìn)行了絕對(duì)定量分析, 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算了各自的表達(dá)量, 以二倍體的為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了表達(dá)倍數(shù)分析(圖1), 結(jié)果發(fā)現(xiàn)在牙鲆二倍體和三倍體不同的組織中, 18S rRNA的表達(dá)在不同倍性之間的差異是不同的。盡管18S rRNA在牙鲆三倍體和二倍體肌肉間的差異在4倍以內(nèi), 但其有顯著性(P=0.024 7)(圖1a); 而其在牙鲆三倍體和二倍體腦間的差異沒(méi)有顯著性(P=0.055 7)。

圖1 牙鲆二倍體和三倍體肌肉、腦組織中18S rRNA的表達(dá)差異Fig. 1 The fold change of 18S rRNA in the muscle and brain of diploid and triploid olive flounder

2.2 牙鲆二倍體和三倍體肌肉和腦中內(nèi)參基因Ct值的分析

Ct值是反映基因表達(dá)量的一個(gè)反應(yīng)閾值, 其值越大, 說(shuō)明表達(dá)量越低; 不同樣品間的數(shù)值差異越小, 樣品間的基因的表達(dá)量差異越小。作者通過(guò)對(duì)ubc-e、ef1-α、rpl17、α-tub、gapdh、b2m和β-actin的Ct值分析(圖2), 發(fā)現(xiàn)它們?cè)诓煌缎灾械牟町惡苄? 但從中也能發(fā)現(xiàn)肌肉中ubc-e和b2m的Ct偏高,在26以上; 腦中ubc-e、gapdh的Ct值在26以上。而從不同個(gè)體的Ct值還可以發(fā)現(xiàn)gapdh和b2m的Ct值在不同倍性的個(gè)體之間差異較大。

圖2 不同基因在牙鲆二倍體和三倍體肌肉和腦中的Ct值Fig. 2 Ct value of different genes in the muscle and brain of diploid and triploid olive flounder

2.3 肌肉和腦中其他7個(gè)基因的表達(dá)倍數(shù)

作者以18S rRNA作為參比基因, 通過(guò)相對(duì)定量對(duì)其他7個(gè)基因的表達(dá)量進(jìn)行了分析, 再通過(guò)各自樣品18S rRNA的絕對(duì)表達(dá)量折算出各基因的表達(dá)量, 最后分別以二倍體肌肉和腦中的表達(dá)量作為基準(zhǔn), 對(duì)他們的表達(dá)量進(jìn)行了倍數(shù)的折算, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅α-tub的表達(dá)在牙鲆三倍體肌肉和二倍體肌肉之間有顯著差異(圖3)(P=0.007 2), 其他6個(gè)基因的表達(dá)沒(méi)有顯著性差異; 而所有基因的表達(dá)在牙鲆三倍體腦和二倍體腦之間并沒(méi)有顯著差異(圖4)。

圖3 絕對(duì)定量方法分析不同基因在牙鲆二倍體和三倍體肌肉中表達(dá)倍數(shù)的差異

圖4 絕對(duì)定量方法分析不同基因在牙鲆二倍體和三倍體腦中表達(dá)倍數(shù)的差異Fig. 4 The fold change of different genes in brain of diploid and triploid olive flounder using absolute quantification method

2.4 以2-ΔCt方法分析表達(dá)倍數(shù)差異

根據(jù)ZHONG等[10]在牙鲆胚胎期內(nèi)參基因篩選的建議, 作者利用2-ΔCt方法對(duì)其他7個(gè)基因的表達(dá)量進(jìn)行了分析[10-11], 以二倍體肌肉和腦中的表達(dá)量為基準(zhǔn), 對(duì)他們的表達(dá)量進(jìn)行了表達(dá)倍數(shù)的折算, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)α-tub的表達(dá)在牙鲆三倍體和二倍體肌肉之間(P=0.032 5)有顯著差異, 其他6個(gè)基因的表達(dá)沒(méi)有顯著性差異(圖5); 而所有基因在牙鲆三倍體和二倍體腦中的表達(dá)均沒(méi)有顯著差異(圖6)。

圖5 2-ΔCt方法分析不同基因在牙鲆二倍體和三倍體肌肉中表達(dá)倍數(shù)的差異Fig. 5 The fold change of different genes in muscle of diploid and triploid olive flounder using 2-ΔCt method

圖6 2-ΔCt方法分析不同基因在牙鲆二倍體和三倍體腦中表達(dá)倍數(shù)的差異Fig. 6 The fold change of different genes in brain of diploid and triploid olive flounder using 2-ΔCt method

2.5 牙鲆三倍體和二倍體肌肉和腦中不同基因表達(dá)穩(wěn)定性的比較

作者對(duì)18S rRNA、ubc-e、ef1-α、rpl17、α-tub、gapdh、b2m和β-actin在不同個(gè)體及不同倍性的肌肉和腦中的表達(dá)進(jìn)行了穩(wěn)定性分析(圖7、圖8)。

利用基因拷貝數(shù)計(jì)算表達(dá)倍數(shù)后發(fā)現(xiàn), 在牙鲆肌肉中這些基因表達(dá)的穩(wěn)定性沒(méi)有顯著性差異(圖7a),但α-tub表達(dá)的變化幅度最小,ubc-e、ef1-α次之,rpl17、β-actin、18S rRNA較次之,gapdh、b2m表達(dá)的變化幅度最大。通過(guò)2-ΔCt值獲取基因表達(dá)倍數(shù)的分析結(jié)果顯示(圖7b), 肌肉中這些基因表達(dá)的穩(wěn)定性沒(méi)有顯著性差異,α-tub表達(dá)的變化幅度最小,ubc-e、ef1-α次之,rpl17、β-actin、18S rRNA較次之,gapdh、b2m的變化幅度最大。

圖7 不同基因在牙鲆二倍體和三倍體肌肉中表達(dá)的穩(wěn)定性分析Fig. 7 The stability of expression of different genes in muscle of diploid and triploid olive flounder

計(jì)算基因拷貝數(shù)進(jìn)行表達(dá)倍數(shù)的分析顯示(圖8a),腦中這些基因表達(dá)的穩(wěn)定性有顯著性差異, 但ef1-α、rpl17、β-actin的變化幅度最小,ubc-e、α-tub次之, 再b2m、gapdh較次之, 18S rRNA表達(dá)的變化幅度最大。通過(guò)2-ΔCt方法獲得基因表達(dá)倍數(shù)的分析表明(圖8 b);腦中這些基因表達(dá)的穩(wěn)定性有顯著性差異,ef1-α、β-actin、rpl17表達(dá)的變化幅度最小,ubc-e、α-tub次之,gapdh、b2m較次之, 18S rRNA表達(dá)的變化幅度最大。

圖8 不同基因在牙鲆二倍體和三倍體腦中表達(dá)的穩(wěn)定性分析Fig. 8 The stability of expression of different genes in brain of diploid and triploid olive flounder

利用NormFinder[12]對(duì)肌肉和腦中18S rRNA、ubc-e、ef1-α、rpl17、α-tub、gapdh、b2m和β-actin的穩(wěn)定性進(jìn)行了分析, 結(jié)果顯示肌肉中穩(wěn)定性最好的是rpl17、β-actin(表2),ef1-α次之,ubc-e較次之;腦中穩(wěn)定性最好的是ef1-α、rpl17,β-actin次之(表3)。

表2 肌肉中基因表達(dá)穩(wěn)定性分析Tab. 2 Gene expression stability analysis in muscle

表3 腦中基因表達(dá)穩(wěn)定性分析Tab. 3 Gene expression stability analysis in brain

3 討論

本研究針對(duì)牙鲆二、三倍體的肌肉和腦組織中的內(nèi)參基因進(jìn)行了篩選, 以期篩選到相對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR較適宜的內(nèi)參基因。

作者發(fā)現(xiàn)利用絕對(duì)定量方法與2-ΔCt方法分析同一內(nèi)參基因差異表達(dá)時(shí)所獲結(jié)果間的差異很小。在篩選內(nèi)參基因時(shí), 使用絕對(duì)定量的優(yōu)勢(shì)是真實(shí)反映了其實(shí)際表達(dá)的情況, 只有保證內(nèi)參基因的表達(dá)符合其實(shí)際情況, 才能篩選到合適的內(nèi)參基因, 但其分析過(guò)程比較復(fù)雜, 需要通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線等一系列過(guò)程才能獲得最終結(jié)果。盡管2-ΔCt方法來(lái)源于相對(duì)定量的2-ΔΔCt方法[11], 但獲得的結(jié)果卻與絕對(duì)定量接近,且其分析過(guò)程較絕對(duì)定量簡(jiǎn)單, 因此在篩選內(nèi)參基因時(shí), 也許使用2-ΔCt方法代替絕對(duì)定量的方法會(huì)更簡(jiǎn)單方便。

在肌肉中通過(guò)絕對(duì)定量分析發(fā)現(xiàn), 18S rRNA和α-tub的表達(dá)在牙鲆二倍體和三倍體中有著顯著性差異, 其他基因沒(méi)有顯著性差異, 這與三倍體鯽魚(yú)中β-actin的表達(dá)量與二倍體的沒(méi)有差異是一致的[9],即出現(xiàn)了劑量補(bǔ)償效應(yīng)[6]。而在2-ΔCt分析方法中發(fā)現(xiàn), 只有α-tub的表達(dá)在牙鲆三倍體和二倍體的肌肉之間有顯著性差異。雖然本實(shí)驗(yàn)所篩選基因的表達(dá)在不同倍性之間的差異很小, 但是穩(wěn)定性分析的結(jié)果表明無(wú)論是絕對(duì)定量分析還是2-ΔCt分析,α-tub的表達(dá)在不同個(gè)體之間以及倍性之間的變化差異最小,是比較適合的內(nèi)參基因,ubc-e和ef1-α次之; 而Normfinder 分析發(fā)現(xiàn)rpl17、β-actin是比較適合的內(nèi)參基因,ef1-α為次合適內(nèi)參基因。因此, 不同方法獲得的內(nèi)參基因并不相同, 也許使用多個(gè)內(nèi)參基因分析更能反應(yīng)實(shí)際表達(dá)的變化[14],ef1-α可以作為牙鲆三倍體和二倍體肌肉中較合適的內(nèi)參基因之一。

在牙鲆三倍體和二倍體的腦中, 無(wú)論是絕對(duì)定量分析還是2-ΔCt分析都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)表達(dá)具有顯著性差異的基因, 因此這些基因的表達(dá)表現(xiàn)出劑量補(bǔ)償效應(yīng)[6]。雖然這些基因的表達(dá)在不同倍性之間的差異很小, 但穩(wěn)定性分析顯示ef1-α、rpl17、β-actin的表達(dá)在不同個(gè)體及倍性之間的穩(wěn)定性最好, 是比較適合的內(nèi)參基因, 且NORMFINDER[12]分析發(fā)現(xiàn)ef1-α、rpl17是比較適合的內(nèi)參基因。因此ef1-α、rpl17是不同倍性牙鲆腦組織中比較適合的內(nèi)參基因。

作者發(fā)現(xiàn)內(nèi)參基因具有組織特異性, 這與其他相關(guān)研究結(jié)果類(lèi)似。比如, ZHENG等[15]在感染病原菌的牙鲆及對(duì)照個(gè)體的內(nèi)參基因篩選過(guò)程中發(fā)現(xiàn)內(nèi)參基因具有組織特異性; 在轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)(Danio rerio)[14]研究中也發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)內(nèi)參基因的篩選也具有組織特異性。有的研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)參基因亦具有物種特異性的特點(diǎn), 以及多個(gè)內(nèi)參基因分析更能反應(yīng)實(shí)際表達(dá)的變化[14]。ZHENG等[15]在牙鲆中獲得的內(nèi)參基因與相同組織下斑馬魚(yú)[14]的內(nèi)參基因不同, ZHONG等[10]獲得適合牙鲆發(fā)育時(shí)期的內(nèi)參基因與牛胚胎期[2]的不同, 作者獲得的適合牙鲆的內(nèi)參基因與斑馬魚(yú)中同一組織的適宜內(nèi)參基因也不同[14]。斑馬魚(yú)中進(jìn)行多個(gè)組織的定量PCR分析時(shí)需要采用多個(gè)內(nèi)參基因[14], ZHONG等[10]在篩選適合牙鲆發(fā)育時(shí)期的內(nèi)參基因時(shí)也發(fā)現(xiàn)同時(shí)用多個(gè)內(nèi)參基因才能符合整個(gè)發(fā)育時(shí)期分析的要求, ZHENG等[15]在篩選牙鲆感染病原菌的內(nèi)參基因時(shí)也出現(xiàn)類(lèi)似的趨勢(shì)。本研究中也發(fā)現(xiàn)不同分析方法獲得較適宜內(nèi)參基因存在差異, 用多個(gè)內(nèi)參進(jìn)行分析是比較可靠的。因此針對(duì)不同物種和組織, 根據(jù)目的需求篩選合適的內(nèi)參基因, 甚至使用多個(gè)內(nèi)參基因進(jìn)行分析, 才能獲得可靠、最優(yōu)的研究結(jié)果。