曹生凱，何 磊，黎 妮，王 星*，于 歡*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病蟲害生物學(xué)與防治湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙 410128)

囊泡病毒是一種環(huán)狀雙鏈DNA昆蟲病毒，因其在感毒感染的昆蟲血淋巴內(nèi)形成包裹著許多病毒粒子的大型囊泡而得名(Federici & Govindarajan, 1990; Asgarietal., 2007)。囊泡病毒的病毒粒子呈棒狀、囊狀或卵圓形，長度約為200～400 nm，直徑約為130 nm(Federicietal., 1990; Asgraietal., 2017)。它們在鱗翅目宿主之間傳播的方式主要通過膜翅目寄生蜂的產(chǎn)卵行為機(jī)械傳播(Govindarajanetal., 1990)。宿主感病之后表現(xiàn)出明顯的急致病性、慢致死性的癥狀，被感染后的幼蟲食量急劇減少，生長發(fā)育緩慢，且無明顯的暴食期(Carneretal., 1983; Lietal., 2013; Huetal., 2016; 劉航等, 2020)。囊泡病毒感染所致的最為典型的癥狀為宿主幼蟲的血淋巴顏色會由澄清變?yōu)闇啙岬哪贪咨?Govindarajanetal., 1990; Bideshietal., 2006; Huangetal., 2012a)。根據(jù)國際病毒分類委員會(International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV)的報(bào)道，囊泡病毒包含兩個屬：分別是囊泡病毒屬Ascovirus和圖爾病毒屬Toursvirus；其中囊泡病毒屬包括草地貪夜蛾囊泡病毒1(Spodopterafrugiperdaascovirus1, SfAV-1)、粉紋夜蛾囊泡病毒6(Trichoplusianiascovirus6, TnAV-6)和煙芽夜蛾囊泡病毒3(Heliothisvirescensascovirus3, HvAV-3)；圖爾病毒屬主要包括雙美緣姬蜂圖爾病毒1(Diadromuspuchellustoursvirus1, DpTV-1)和棗癭蚊圖爾病毒2(Dasineurajujubifoliatoursvirus2, DjTV-2)(Asgraietal., 2017; Wangetal., 2020)。

煙芽夜蛾囊泡病毒3h株(Heliothisvirescensascovirus3h, HvAV-3h)于2012年由本實(shí)驗(yàn)室分離獲得，并在2017年完成了全基因組測序，基因組全長190 519 bp，G+C含量為45.5%，預(yù)測編碼185個開放閱讀框(Open Reading Frame, ORF)，主要對斜紋夜蛾Spodopteralitura(Fabricius)、棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(Hübner)、甜菜夜蛾Spodopteraexigua(Hübner)等具有高致病性(Huangetal., 2012; Huangetal., 2017)。在細(xì)胞水平上，囊泡病毒的感染過程是類似細(xì)胞凋亡(Apotopsis-like)的病理反應(yīng)，即宿主細(xì)胞會隨著囊泡病毒的感染和復(fù)制，出現(xiàn)類似細(xì)胞凋亡的形態(tài)特征，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入感染后期，大量含有病毒粒子的囊泡會隨著類凋亡小體的形成被釋放到血淋巴中(Bideshietal., 2005; Bideshietal., 2006)。這種在細(xì)胞水平上囊泡病毒所展現(xiàn)出來的特殊的致病現(xiàn)象提示囊泡病毒具有特殊的致病機(jī)制，同時(shí)也敦促著我們對囊泡病毒基因功能進(jìn)行更深入的研究，從而為囊泡病毒特殊致病性和致病歷程的探明奠定基礎(chǔ)。

本研究針對HvAV-3h的一個基因(3h-38)進(jìn)行了初步的功能分析，通過制備的特異性多克隆抗體對其在HvAV-3h感染甜菜夜蛾后的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)時(shí)相進(jìn)行了檢測。獲得的結(jié)果為進(jìn)一步深入研究3H-38在病毒侵染中的具體功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 昆蟲飼養(yǎng)和HvAV-3h擴(kuò)繁

甜菜夜蛾幼蟲由本實(shí)驗(yàn)室采用人工飼料飼喂，人工飼料具體配置方法及飼養(yǎng)條件參考Li等(2013)和Hu等(2016)報(bào)道的方法(Lietal., 2013; Huetal., 2016)。

HvAV-3h株按照本實(shí)驗(yàn)室Li等(2013)報(bào)道的方法擴(kuò)繁和保存。幼蟲生長至3齡時(shí)(蛻皮12～24 h內(nèi))，用微型針平行針刺健康的3齡甜菜夜蛾幼蟲的腹足，收集感染幼蟲的血淋巴作為含毒血淋巴，同時(shí)收集未被病毒感染的幼蟲血淋巴即無毒血淋巴作對照，于-20±1℃保存?zhèn)溆?Lietal., 2013)。

1.2 3h-38的序列分析

通過NCBI ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)把DNA序列翻譯成氨基酸序列，使用Expert Protein Analysis System工具(http://expasy.org/tools/)推導(dǎo)3h-38基因編碼蛋白質(zhì)的相對分子量等理化性質(zhì)。根據(jù)Zhao等(2019)報(bào)道的方法使用BLAST軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)將3H-38序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中蛋白序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行比較分析；Geneious 4.8.4版本(Biomatters Ltd)、DNAMAN(Lynnon corporation)軟件進(jìn)行序列比對，應(yīng)用在線分析工具Signal P(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對蛋白信號肽序列、TMP-red在線分析軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對跨膜區(qū)、使用Pfam在線工具(http://pfam.xfam.org/search)對蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測分析(Zhaoetal., 2019)。

1.3 3h-38基因的克隆

取感染HvAV-3h后72 h的幼蟲，以TRI Reagent? RNA/DNA/Protein Isolation Reagent(Molecular Research Center, USA)提取蟲體的總RNA，再根據(jù)GoScriptTMReverse Transcription Mix，Oligo(dT)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega, USA)的使用說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)，將制備好的cDNA樣品儲存于-20℃±1℃。根據(jù)Huang等報(bào)道的HvAV-3h基因組序列(GenBank登錄號：KU170628.1)及其對HvAV-3h各開放閱讀框的預(yù)測，設(shè)計(jì)3h-38的基因的編碼區(qū)特異性引物3h-38-F(5′-GAATTCATGCAGTCGACTGATTTATTT-3′，下劃線部分為EcoRI酶切位點(diǎn))和3h-38-R(5′-CTCGAGTTATGAGTGATTTATTGCATTAT-3′，下劃線部分為XhoI酶切位點(diǎn))。以制備的cDNA為模板，使用3h-38-F/3h-38-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?4℃初始變性5 min，94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸2 min，進(jìn)行40個擴(kuò)增循環(huán)。擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠凝膠電泳檢測后利用V-ELUTE Gel Mini purification Kit(北京莊盟國際生物基因科技有限公司)回收目的基因的DNA片段。回收后根據(jù)pGEM-T Easy Vector System I試劑盒使用說明(普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司)和克隆載體相連，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入EscherichiacoliTG1感受態(tài)細(xì)胞中，通過藍(lán)白斑篩選和氨芐青霉素抗性篩選獲得含重組質(zhì)粒(pGEM-T-38)的陽性克隆菌株?？寺∑涡蛄械臏?zhǔn)確性進(jìn)一步通過測序確認(rèn)(擎科生物技術(shù)有限公司)。

1.4 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

采用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI和XhoI(TaKaRa)對構(gòu)建好的pGEM-T-38和pET-28a(+)載體分別進(jìn)行雙酶切，用凝膠回收試劑盒分別回收目的基因片段和載體片段；回收產(chǎn)物采用T4DNA連接酶(目的基因片段和載體片段體積比為5∶3)在4℃反應(yīng)過夜；通過熱激轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coliTG1感受態(tài)細(xì)胞中，向菌液中加入1 mL的S.O.C.培養(yǎng)基于37℃，200 rpm震蕩培養(yǎng)45 min～1 h；LB固體培養(yǎng)基平板上經(jīng)卡那霉素抗性篩選后挑取陽性克隆于3 mL LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素50 μg/mL)中，在37℃，200 rpm震蕩培養(yǎng)10～12 h后收集菌液，利用Fast Plasmid Minprep Kit(北京莊盟國際生物基因科技有限公司)提取質(zhì)粒；再以EcoRI和XhoI對篩選獲得的重組載體質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，獲得3h-38的原核表達(dá)載體(pET-28a-38)。

1.5 重組質(zhì)粒的表達(dá)及蛋白純化

將pET-28a-38轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)卡那霉素抗性篩選，在LB固體培養(yǎng)基挑取陽性單菌落，37℃，200 rpm培養(yǎng)過夜后提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行雙酶切鑒定，檢測表達(dá)載體是否構(gòu)建成功。取100 μL培養(yǎng)物接種到具有相同組成的3 mL LB液體培養(yǎng)基中，并在37℃，200 rpm下生長約2～3 h(直到OD600達(dá)到0.6～0.8)。通過加入3 μL 1 mM異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside, IPTG)誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)，然后在37℃，200 rpm條件下培養(yǎng)12 h。取1.5 mL菌液，利用SDS-PAGE凝膠電泳和考馬斯亮藍(lán)染色檢測菌體中目的蛋白的表達(dá)情況。當(dāng)目的蛋白表達(dá)成功后，利用超聲波破碎細(xì)胞，最后利用鎳螯合親和層析柱(Ni2+-NTA SefinoseTMResin Settled Resin)純化回收目的蛋白，最后將純化的目的蛋白送至中國武漢病毒研究所，制備多克隆抗體。

1.6 轉(zhuǎn)錄分析

根據(jù)1.1所述的方法，分別將含有HvAV-3h的血淋巴(處理組)和健康幼蟲的血淋巴(對照組)接種至甜菜夜蛾3齡幼蟲(蛻皮后12～24 h)血腔內(nèi)；在HvAV-3h接種后的3、6、12、24、48、72、96、120和168 h收取試蟲；對照組僅收取健康血淋巴接種后24 h的蟲體(模擬接種，mock)；根據(jù)TRI Reagent? RNA/DNA/Protein Isolation Reagent International Patents試劑盒(molecular research center, USA)說明，提取各處理幼蟲的總RNA，根據(jù)GoScriptTMReverse Transcription Mix，Oligo(dT)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega, USA)的使用說明制備各樣品的cDNA，使用3h-38-F/3h-38-R特異性引物以及本實(shí)驗(yàn)保存的甘油醛-3-磷酸脫氫酶編碼基因(GAPDH)特異性引物進(jìn)行40個循環(huán)(95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min)的PCR，然后在1%瓊脂糖凝膠上分析聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物。

1.7 表達(dá)分析

在1.5的基礎(chǔ)之上，繼續(xù)用提取總RNA的有機(jī)相按照操作說明書，提取各樣品的總蛋白；向制備好的蛋白樣品以1/6體積的比例加入5×Protein Loading Buffer(北京索萊寶)，沸水浴13 min后，將制備好的蛋白樣品上樣于12% SDS-PAGE膠上，以80 v至120 v的電泳分離蛋白樣品中的各蛋白條帶；電泳結(jié)束后，根據(jù)預(yù)染maker(PageRulerTMPrestained Protein Ladder, Thermo Scinetific, USA)的指示，割取目的蛋白大小附近的膠塊，轉(zhuǎn)印于醋酸纖維膜(nitrocellulose membrane, Millipore, USA)上；經(jīng)過封閉液(5%脫脂奶粉溶于TBST buffer)室溫孵育1.5 h，分別以His-Tag 3H-38兔多抗(Proteintech, CHN, 1∶4 000)和甜菜夜蛾甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)的多克隆抗體(1∶4 000)進(jìn)行一抗孵育(4℃過夜)；以TBST漂洗雜交膜3次，每次5 min，隨后以辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔(horseradish peroxidase(HRP)conjunct goat-anti-rabbit IgG)(購自陜西先鋒生物技術(shù)有限公司)作為二抗(1∶5 000)，進(jìn)行二抗雜交(室溫孵育2 h)；以TBST漂洗雜交膜3次，每次5 min，利用Immobilon Western HRP Substrate Luminol Reagent(Millipore, Cat#WBKLS0500)對雜交膜進(jìn)行顯色反應(yīng)，并在ChemiDocTMXRS+成像儀(BIO-RAD, USA)下拍攝免疫印跡反應(yīng)條帶的圖像。針刺模擬感染的幼蟲用作對照，GAPDH用作內(nèi)參蛋白(Yuetal., 2018)。

2 結(jié)果與分析

2.1 3h-38的序列分析

3h-38由1 080個堿基對(base pair, bp)組成，預(yù)測其編碼一條由360個氨基酸殘基組成的蛋白(3H-38)，相對分子量約為40.357 kDa，等電點(diǎn)(protein isoelectric point, pI)為7.63。根據(jù)Net-Phos預(yù)測出N端23～121氨基酸位置有一個BRO家族結(jié)構(gòu)域，應(yīng)用Signal P、TMP red等工具分析推測的氨基酸序列未發(fā)現(xiàn)信號肽，從131～150氨基酸位置有一段由胞外向胞內(nèi)的跨膜區(qū)序列(score:568)，在228～316位置有一個未知功能的保守結(jié)構(gòu)域(DUF3627)(圖1)。同源蛋白氨基酸序列比對結(jié)果表明：3H-38與HvAV-3j-43(ORF43)、HvAV-3i-40(ORF40)相似性達(dá)到了85%以上，和HvAV-3e-39(ORF39)、TnAV-6b-149(ORF149)的相似性達(dá)到了75%以上，和HvAV-3g-45(ORF45)、SfAv-1a-79(ORF79)的相似性達(dá)到了60%以上，此外和TnAv-6a-137(ORF137)的相似性為29.53%，和DpAv-4a-110(ORF110)的相似性最低，為19.09%(圖1)。

圖1 3H-38與其同源蛋白的多重序列對比

2.2 3h-38的克隆和重組表達(dá)載體的鑒定

通過特異性引物擴(kuò)增后，得到了1 080 bp的目的片段(圖2-A)。將重組的pGEM-T-38質(zhì)粒通過對應(yīng)的限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoI進(jìn)行雙酶切檢測后，泳道2除了一條約3 015 bp的載體片段外，還有與目的基因大小一致的條帶，其大小為1 080 bp(圖2-B)。將目的條帶回收純化后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 目的基因的PCR擴(kuò)增及pGEM-T-38酶切鑒定

2.3 3H-38原核表達(dá)和蛋白純化

對獲得的原核表達(dá)載體pET-28a-38雙酶切檢測后，3泳道除了5 369 bp的載體片段外，還有和目的基因大小一致的條帶(圖3)，這表明重組表達(dá)載體構(gòu)建成功，可以進(jìn)行后續(xù)的誘導(dǎo)純化。

圖3 pET-28a-38雙酶切鑒定

通過IPTG誘導(dǎo)后，3h-38自身可以表達(dá)40.35 kDa的蛋白，而由于pET-28a載體自身可以表達(dá)出大約3.7 kDa的標(biāo)簽蛋白，故預(yù)測3h-38可表達(dá)44 kDa的蛋白。結(jié)果表明含有pET-28a-38的BL21(DE3)全菌裂解產(chǎn)物有可溶性的蛋白(泳道2)，超聲破碎后的上清中不存在3H-38的可溶性蛋白(泳道3)，超聲破碎后被8 M脲溶液溶解的包涵體中存在可溶性的蛋白(泳道4)，這說明重組蛋白都變成包涵體溶解于8 M的脲溶液中。用不同pH的8 M脲溶液對目的蛋白進(jìn)行洗脫(泳道5～14)，3H-38蛋白首先從pH 5.9的脲溶液被洗脫出來(泳道9)，在10～14泳道都檢測到被洗脫的可溶性蛋白。最終選取從Buffer D(pH 5.9)(泳道10，黑色箭頭標(biāo)注)洗脫出的蛋白，將其濃度調(diào)到1 μg/mL用于制備多克隆抗體(圖4)。

圖4 3H-38的表達(dá)純化

2.4 3h-38在甜菜夜蛾體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)分析

為了確定3h-38是否在甜菜夜蛾體內(nèi)被轉(zhuǎn)錄，從模擬感染和HvAV-3h感染后不同時(shí)間點(diǎn)的甜菜夜蛾幼蟲體內(nèi)提取總RNA進(jìn)行RT-PCR分析，RT-PCR結(jié)果顯示對照組未檢測到明顯的單一條帶，3h-38在模擬感染的甜菜夜蛾幼蟲體內(nèi)無轉(zhuǎn)錄，處理組在感染3 h(hour post infection, hpi)時(shí)檢測到單一的條帶(大小約為0.6 kb)，該條帶到168 hpi仍可檢測到，這些結(jié)果表明3h-38基因是一個在甜菜夜蛾體內(nèi)早期轉(zhuǎn)錄的基因(圖5)。

圖5 HvAV-3h感染的甜菜夜蛾幼蟲中3h-38轉(zhuǎn)錄分析

使用抗3H-38特異性兔抗血清進(jìn)行Western blotting檢測，結(jié)果顯示3H-38蛋白首先在36 hpi檢測到，到168 hpi仍然可檢測到，其大小約40 kDa，和預(yù)期大小相符，表明3H-38蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)錄翻譯后沒有發(fā)生重大的修飾，在模擬感染的幼蟲體內(nèi)未檢測到3H-38的表達(dá)。GAPDH作為內(nèi)參抗體在每個時(shí)間段都能夠檢測到(圖6)。

圖6 HvAV-3h感染的甜菜夜蛾幼蟲中3H-38表達(dá)分析

3 結(jié)論與討論

本研究對3H-38蛋白序列進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)3H-38與HvAV-3j-43(ORF43)、HvAV-3i-40(ORF40)相似性達(dá)到了85%以上。在線分析顯示3H-38蛋白N端有一個未知功能的序列(DUF3627)，N端23～121氨基酸位置有一個BRO家族結(jié)構(gòu)域。雖然3H-38的N端被預(yù)測到含有一個bro基因家族結(jié)構(gòu)域，但是其作用和功能還是未知的。在桿狀病毒中，家蠶核型多角體病毒(Bombyxmorinucleopolyhedrovirus, BmNPV)可以編碼5個bro基因，而其指導(dǎo)編碼的BRO蛋白在病毒感染抑制宿主mRNA翻譯方面有一定的作用，其N端氨基酸序列還有核輸出信號的作用(Kangetal., 2006; Kotanietal., 2015)。此外，蛋白結(jié)構(gòu)分析還表明3H-38在131～150氨基酸位置有一段由胞外向胞內(nèi)的跨膜區(qū)序列，在鼠肝炎病毒(Murinehepatitisvirus, MHV)S蛋白中也存在一段由胞外向胞內(nèi)的跨膜區(qū)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這段跨膜區(qū)和病毒顆粒的裝配有關(guān)，也具有病毒膜融合的功能(Yeetal., 2004)。這也提示著3H-38蛋白在病毒感染宿主過程也具有類似復(fù)雜功能。

本研究還檢測了3h-38基因在感染HvAV-3h甜菜夜蛾體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄本，結(jié)果顯示3h-38基因3 hpi開始在甜菜夜蛾體內(nèi)轉(zhuǎn)錄，而其編碼的蛋白在36 hpi開始表達(dá)。Kang等人表征了BmNPV的5個bro基因(bro-a、bro-b、bro-c、bro-d、bro-e)轉(zhuǎn)錄發(fā)生在感染后2～4 h(Kangetal., 1999)，略早于3h-38基因的轉(zhuǎn)錄起始時(shí)間。3H-38的表達(dá)始于感染后36 h，較3h-38轉(zhuǎn)錄的起始時(shí)間相比，有30 h以上的延后(圖5-6)。雖然病毒基因的表達(dá)較轉(zhuǎn)錄有所推遲在其他報(bào)道中也有出現(xiàn)，如董戰(zhàn)旗等分析lef-11基因及其編碼蛋白質(zhì)在BmNPV侵染的家蠶卵巢培養(yǎng)細(xì)胞BmN中的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)時(shí)相，發(fā)現(xiàn)lef-11從侵染后6 h開始轉(zhuǎn)錄，蛋白質(zhì)從侵染后12 h開始持續(xù)表達(dá)(董戰(zhàn)旗等, 2016)；張楠等分析苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographacalifornicanucleopolyhedrovirus, AcMNPV)bro基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)時(shí)相中也有表明AcMNPV的ac-bro基因在感染后6 h開始轉(zhuǎn)錄，在8 h檢測到表達(dá)(張楠等, 2016)，但這些延遲遠(yuǎn)沒有3h-38明顯。在已報(bào)道的HvAV-3h的結(jié)構(gòu)蛋白3H-117和3H-21的表達(dá)相對轉(zhuǎn)錄的起始分別延遲了16 h和24 h，雖比本研究中3H-38的延遲短，但也明顯比桿狀病毒功能基因中的延遲更明顯，這可能與囊泡病毒自身的特殊性相關(guān)(Zhaoetal., 2019; Zhaoetal., 2020)

本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)分析了3H-38蛋白的結(jié)構(gòu)，檢測了3h-38基因在感染HvAV-3h甜菜夜蛾幼蟲體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平和其編碼蛋白的表達(dá)時(shí)相，展示了HvAV-3h的3H-38蛋白的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)特性，為后續(xù)闡述3H-38功能、解明HvAV-3h的致病機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。