吳一弘，陳國慶，王文凱，馮國忠*

(1.長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北荊州 434025；2.中國水稻研究所/水稻生物學(xué)國家重點實驗室，杭州 310006)

昆蟲是地球上數(shù)量最多的動物群體，昆蟲的生理活動依賴于細胞中信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)及各種基因的有序性表達。核質(zhì)轉(zhuǎn)運過程是真核生物細胞核膜內(nèi)外物質(zhì)平衡的基礎(chǔ)(Lusk and King, 2017)。在細胞生命活動周期中，無論是轉(zhuǎn)錄因子類穿梭蛋白的核質(zhì)轉(zhuǎn)運、細胞分裂末期肌動蛋白的核內(nèi)外平衡，還是未成熟的mRNA及各種小RNA的轉(zhuǎn)運等都需要跨過細胞質(zhì)與細胞核之間的核膜屏障。核膜內(nèi)外周聚集著多種助力核質(zhì)轉(zhuǎn)運的蛋白，組裝出復(fù)雜的核質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)。在昆蟲的胚胎發(fā)育、代謝循環(huán)和免疫機制等生命活動中，一些重要的穿梭蛋白或RNA通過核輸出機制從細胞核轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)中，行使其功能或進一步加工成熟。核輸出的受阻使這些穿梭蛋白的功能遭受嚴重破壞，相應(yīng)信號通路無法繼續(xù)響應(yīng)，嚴重時導(dǎo)致昆蟲細胞死亡(Mason and Goldfarb, 2009)。

桿狀病毒等病原物在侵入昆蟲細胞并進行增殖時，也會爭奪宿主的眾多細胞器以及核質(zhì)轉(zhuǎn)運裝置使病毒蛋白順利穿梭核膜，同時也會抑制宿主編碼的抗病毒因子mRNA的表達或分解宿主核膜蛋白組分以利于其在宿主細胞內(nèi)的增殖復(fù)制。本文主要描述核質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)、蛋白核輸出的基本機制及果蠅等昆蟲中核輸出的功能，簡單介紹桿狀病毒及一些蟲媒病毒等對昆蟲等宿主核輸出機制的利用情況。

1 核孔復(fù)合體

真核生物的細胞核被核膜包被，基因組存在于細胞核內(nèi)，確保了遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性。核膜在空間上分隔開細胞核與細胞質(zhì)的各種內(nèi)容物，并在細胞分裂時短暫的消失，這是真核生物區(qū)別于原核生物的一個典型特征。真核生物基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯等表達調(diào)控過程中，核膜屏障在確保中心法則的核質(zhì)交換時各細胞器有序地運且轉(zhuǎn)互不干擾，保證細胞代謝運轉(zhuǎn)的高效性和穩(wěn)定性。不同的細胞器由膜狀結(jié)構(gòu)隔開，不同隔膜內(nèi)的細胞器也需要廣泛的信息交換。因此，分子之間需要頻繁且可靠地進行跨膜運輸，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和高爾基等細胞器通過不同的途徑進行信息交換，包括信號通路、轉(zhuǎn)運體和囊泡運輸?shù)?。細胞核和細胞質(zhì)之間的分子跨核膜運輸主要通過鑲嵌在核膜上的核孔復(fù)合體(Nuclear pore complex, NPC)完成。NPC是一種巨大的蛋白質(zhì)復(fù)合體，大約由30多種不同的核孔蛋白(Nucleoporin, Nup)重復(fù)16份拷貝組成一個八面對稱的輪狀結(jié)構(gòu)，外徑120 nm，高度70 nm，預(yù)測分子量為50～110 MDa(Devosetal., 2014; Guglielmietal., 2020)。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的環(huán)狀片層(Annulate lamellae, AL)上也存在一些類似NPC的結(jié)構(gòu)，稱為ALPC，但是沒有核籃(Nuclear basket)與中心通道等結(jié)構(gòu)(Hampoelzetal., 2016)。核質(zhì)轉(zhuǎn)運系統(tǒng)可以分為固定和流動兩個部分，固定在NPC中的Nup包括多螺旋結(jié)構(gòu)域與跨膜結(jié)構(gòu)域的Scaffold-Nup和富含苯丙氨酸-甘氨酸(FG)重復(fù)序列的FG-Nup，可移動部分的核轉(zhuǎn)運受體蛋白(Karyopherin, Kap)短暫地結(jié)合至FG-Nup上運輸貨物蛋白。釀酒酵母Saccharomycescerevisiae中絕大部分的Nup位于NPC中，少量Nup存在于核仁、核散斑及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等結(jié)構(gòu)。其中Scaffold-Nup構(gòu)成NPC的結(jié)構(gòu)框架，嵌合在核膜上，建立起一個內(nèi)徑大約50 nm的疏水通道，F(xiàn)G-Nup結(jié)合Kap并引導(dǎo)Kap-載運蛋白cargo復(fù)合體的運輸(Routetal., 2000; Denningetal., 2003; Hampoelzetal., 2019; Mobbs and Hoelz, 2020)。

2 核質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白

2.1 Ran蛋白

Ran(Ras-related nuclear protein)是一種廣泛存在的小分子G蛋白，在介導(dǎo)蛋白核質(zhì)轉(zhuǎn)運中起重要的調(diào)節(jié)作用，翻譯后通過賴氨酸乙酰化起調(diào)節(jié)作用，泛素化的RanGTP酶激活蛋白(Ran GTPase-activating protein, RanGAP)在脊椎動物、酵母及植物中的氨基酸序列修飾及靶向作用存在很大差別(Mahajanetal., 1997; Quimby and Dasso, 2003)。Ran主要與核質(zhì)轉(zhuǎn)運相關(guān)，同時Ran在與組蛋白H3/H4結(jié)合促進NPC的組裝、纖毛的形成以及微管的聚合等方面具有諸多調(diào)控功能，并與細胞有絲分裂中紡錘體的形成、維持和調(diào)控相關(guān)，通過釋放紡錘體組裝因子(Spindle assembly factor, SAF)介導(dǎo)有絲分裂功能，Ran與幼蟲神經(jīng)干細胞的時序性發(fā)育密切相關(guān)，敲除致死(Kahana and Cleveland, 1999; Dasso, 2001; Chenetal., 2015; Wuetal., 2019)。昆蟲能通過上調(diào)Ran的表達進而調(diào)控NTF2(Nuclear transport factor 2)介導(dǎo)的核輸入，提高多個解毒酶(Cyp4d20、Cyp4ae1、GstD5、Sod3)表達的效率以應(yīng)對溴氰菊酯等藥物的脅迫作用(Liuetal., 2016a; Karamipouretal., 2019)。家蠶核型多角體病毒(Bombyxmorinucleopolyhedrovirus, BmNPV)和苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(Autographacalifornicamultiplenucleopolyhedrovirus, AcMNPV)在感染宿主過程中通過編碼microRNA(miRNA)下調(diào)宿主Ran蛋白的表達，從而調(diào)節(jié)宿主小RNA介導(dǎo)的防御機制(Singhetal., 2012; Karamipouretal., 2019)。

2.2 RanGTP-RanGDP循環(huán)

Ran與Kap之間的相互作用調(diào)節(jié)貨物蛋白的運輸，Ran與GDP或GTP組成不同形式的Ran蛋白穿梭于核膜兩側(cè)。RanGDP主要分布在細胞質(zhì)中，RanGTP主要分布在細胞核中，在核膜兩側(cè)形成RanGTP濃度梯度決定核質(zhì)轉(zhuǎn)運的方向(Quimby and Dasso, 2003)。在RanGTP與RanGDP循環(huán)及核質(zhì)轉(zhuǎn)運中，Kap與細胞質(zhì)中的貨物蛋白結(jié)合進入細胞核內(nèi)，再與RanGTP結(jié)合釋放貨物蛋白，Kap-RanGTP復(fù)合物再次進入細胞質(zhì)循環(huán)；核輸出時，RanGTP和貨物蛋白分別結(jié)合Kap，在穿過NPC后，RanGTP在細胞質(zhì)中水解成RanGDP，導(dǎo)致復(fù)合體的解體，釋放出貨物蛋白。細胞質(zhì)中RanGAP激活RanGTPase水解RanGTP，產(chǎn)生的RanGDP通過專用的NTF2轉(zhuǎn)運入核，RanGDP在細胞核內(nèi)的Ran鳥嘌呤-核苷酸交換因子(Ran guanine-nuclear exchange factor, RanGEF)以及調(diào)控染色體濃縮調(diào)節(jié)因子(Regulator of chromosome condensation 1, RCC1)促進下與GTP轉(zhuǎn)化為RanGTP及GDP。RanGTPase系統(tǒng)為貨物蛋白結(jié)合和釋放的主動控制提供核質(zhì)轉(zhuǎn)運周期中唯一的能量輸入，這種RanGTP-RanGDP的不同區(qū)域循環(huán)也是RanGTP核質(zhì)內(nèi)外濃度梯度差產(chǎn)生的主要原因(Weis, 2003; Mosammaparast and Pemberton, 2004; Fanetal., 2011; Hampoelzetal., 2019)。

2.3 核轉(zhuǎn)運受體

離子和小分子物質(zhì)包括能被FG-Nup識別并互作的小分子蛋白質(zhì)可以通過擴散穿過NPC，疏水殘基以及帶正電荷的精氨酸殘基等具有顯著的促進轉(zhuǎn)運效果(Timneyetal., 2016; Freyetal., 2018)。而生物大分子的核質(zhì)穿梭受限于體積與分子量的大小。一般直徑小于5nm或者分子量小于40 kDa的蛋白質(zhì)也可以自由通過NPC，分子量大于40 kDa的蛋白質(zhì)及一些RNA的轉(zhuǎn)運需要依賴于核轉(zhuǎn)運受體蛋白Kap的協(xié)助。Kap屬于高度保守的Karyopherin-β(Kapβ)超家族，不同物種之間Kap的數(shù)量也不等，例如在釀酒酵母中存在14種Kap，而哺乳動物中存在20種以上的Kap(Gorlichetal., 1997; Tessieretal., 2019)。Kap分子量范圍在90～145 kDa, Kap包含一個N端結(jié)構(gòu)域用于結(jié)合RanGTP，并可以直接與NPC中的Nup相互作用。Kap可分為核輸入受體蛋白(Importin)與核輸出受體蛋白(Exportin)，通過識別貨物蛋白的核輸入信號(Nuclear localization signal, NLS)或核輸出信號(Nuclear export signal, NES)直接與底物蛋白相互作用。Kap也可通過接頭蛋白(Adaptor protein)識別底物，將底物運送進細胞核或運輸出細胞核(Mosammaparast and Pemberton, 2004; Xuetal., 2010)。

核輸出因子(Nuclear export factor, NXF)是另一類保守的核轉(zhuǎn)運因子，NXF主要將未成熟的mRNA前體復(fù)合物及病毒的RNA轉(zhuǎn)運出細胞核，NXF的功能依賴于NXF與NTF2-related export protein(NXT)的異源二聚體結(jié)合(Blacketal., 1999)。NXF與典型的核輸出受體相似，能識別FG重復(fù)序列并與相關(guān)Nup相互作用，從而介導(dǎo)mRNA復(fù)合體的出核轉(zhuǎn)運(Izaurralde, 2002)。在黑腹果蠅DrosophilamelanogasterS2細胞中，NXF1缺失時，無內(nèi)含子與剪切體的poly(A)+ mRNA無法運輸出細胞核(Heroldetal., 2001)。利用RNA標記技術(shù)發(fā)現(xiàn)NXF2與NXF3具有介導(dǎo)mRNA的核輸出活性，但在內(nèi)源性mRNA底物核輸出中的功能尚不明確(Heroldetal., 2000; Yangetal., 2001)。此外，在酵母等真核生物中，Mtr2p、Yra1p、EJC、Nab2p、Sac3p、Gle2p等蛋白被報道參與RNA轉(zhuǎn)運出核過程的不同階段，具體蛋白功能詳見(Erkmann and Kutay, 2004)。

2.3.1Importin介導(dǎo)的入核轉(zhuǎn)運

在Kap-RanGTP轉(zhuǎn)運模型中，大分子蛋白質(zhì)主動運輸進入細胞核，需要含有富含堿性氨基酸NLS作為識別信號，目前研究最多的是經(jīng)典型核定位信號(classical NLS, cNLS)，此外還有諸多類型的核定位信號，包括空間型核定位信號、隱秘型核定位信號和多分型核定位信號等。典型的cNLS是猿猴病毒SV40大T抗原上一段單分型cNLS(PKKKRKV)及核蛋白上一段雙分型cNLS(KRPAATKKAGQAKKKK)，根據(jù)這些特點建立起NLS預(yù)測公式(表1)(Kalderonetal., 1984; Robbinsetal., 1991; Marforietal., 2011)。Importin α又稱為Karyopherin α，Importin β又稱為Karyopherin β，具有cNLS的貨物蛋白與Importin α的犰狳重復(fù)(Armadillo repeat)序列結(jié)合，Importin α的N端識別Importin β的結(jié)合域(Importin β binding domain, IBB)并結(jié)合，形成Cargo-Importin α-Importin β復(fù)合體，經(jīng)NPC中的FG-Nup識別后被胞質(zhì)環(huán)纖維推入中心通道，進入細胞核后RanGTP與Importin β結(jié)合將貨物蛋白從復(fù)合體中釋放出來，完成貨物蛋白轉(zhuǎn)運入核(Contietal., 1998; Goldfarbetal., 2004; Kimura and Imamoto, 2014)。蛋白質(zhì)入核過程如圖1-A所示。在透化細胞中，Importin β在沒有攜帶Importin α或Cargo且無外源能量時，又能以不依賴于Ran循環(huán)的方式轉(zhuǎn)運進細胞核(Koseetal., 1997)。黑腹果蠅中主要存在三種Importin α(Importin α1、Importin α2和Importin α3)，三者相互之間同源性在42%～46%之間，Importin α1和Importin α2突變體配子存在缺陷，Importin α3突變導(dǎo)致幼蟲在1齡或2齡期間死亡(Goldfarbetal., 2004; Ratanetal., 2008)。

2.3.2Exportin介導(dǎo)的出核轉(zhuǎn)運機制

Exportin介導(dǎo)的出核轉(zhuǎn)運機制與Importin介導(dǎo)的入核轉(zhuǎn)運機制稍有不同，exportin識別的貨物蛋白密集富含亮氨酸(Leu)等疏水性氨基酸的NES。經(jīng)典型NES最早是從人類免疫缺陷病毒I型(Humanimmunodeficiencyvirustype1, HIV-1)的REV蛋白上鑒定而來(Meyeretal., 1996)，目前已經(jīng)在超過300種蛋白中鑒定到NES序列，如轉(zhuǎn)錄因子、核糖核蛋白和病毒蛋白等，依據(jù)這些NES特點得到一個較為寬泛的NES典型特征序列模式：Φ-X2-3-Φ-X2-3-Φ-X-Φ(Φ為L/I/V/F/M，X代表任意氨基酸)(表1)(la Couretal., 2004)。與cNLS不同，NES的預(yù)測經(jīng)常不準確，NES能以氮端-碳端或碳端-氮端的方向結(jié)合染色體維持蛋白(Chromosomal region maintenance, CRM1)，使得NES具有多樣性(Fungetal., 2017)。三元復(fù)合物Cargo-Exportin-RanGTP經(jīng)NPC從細胞核轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)中，Ran結(jié)合蛋白(Ran binding protein, RanBP)中含有NES及Ran結(jié)合域的RanBP1將RanGTP從三元復(fù)合體中解離釋放出來，RanGAP水解RanGTP后釋放貨物蛋白完成蛋白質(zhì)的出核轉(zhuǎn)運(圖1-B)(Fukudaetal., 1997; Floer and Blobel, 1999; Koyama and Matsuura, 2010)。

圖1 核質(zhì)轉(zhuǎn)運示意圖

表1 NLS和NES模序的典型特例及其代表性序列

3 真核生物核輸出途徑及其細胞功能

RNA的核輸出途徑主要通過NXF-NXT轉(zhuǎn)運出核，然而近年發(fā)現(xiàn)多種不同的exportin也能介導(dǎo)各類RNA的核輸出，exportin的“貨物”更加多樣。雖然一些小分子的蛋白能自由通過NPC，但是一些與FG-Nup親和力較高的小分子蛋白能更高效快速地通過NPC，這表明一些小分子蛋白能通過FG-Nup或exportin出核，實現(xiàn)更快的出核轉(zhuǎn)運速率。因此，本章僅介紹各種exportin的功能及這些exportin典型的貨物蛋白。

exportin在高等真核生物中普遍存在，目前在酵母、果蠅及人類細胞中已發(fā)現(xiàn)的核輸出受體共有7類，包括XPO1(也稱CRM1/EMB1)、XPO2(也稱CSE1/CAS)、XPO4、XPO5、XPO6、XPO7和XPOt等(Kimura and Imamoto, 2014)。眾多exportin分別協(xié)助不同類型大分子的核質(zhì)轉(zhuǎn)運，CRM1是最主要的核輸出受體蛋白，包括昆蟲病毒蛋白、生長調(diào)節(jié)蛋白及腫瘤抑制因子等絕大多數(shù)需要出核轉(zhuǎn)運貨物蛋白經(jīng)由CRM1途徑介導(dǎo)出核，Leptomycin B(LMB)及一些烷基化試劑能與CRM1結(jié)合并抑制這一途徑(Kudoetal., 1998; Kangetal., 2006; Hutten and Kehlenbach, 2007)。其它的幾個核輸出受體研究較少，Cse1/CAS主要介導(dǎo)Importin α的出核，并參與染色體的分離，是有絲分裂中細胞周期蛋白B降解所必需的(Scherfetal., 1996)。CAS還是幾種增殖激活蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、癌基因和腫瘤抑制基因產(chǎn)物如p53和BRCA1的核輸出所必需的(Behrensetal., 2003)。xpo4也是一種腫瘤抑制基因，與人類肝癌密切相關(guān)。XPO4能雙向轉(zhuǎn)運，介導(dǎo)真核翻譯起始因子eIF5A及轉(zhuǎn)錄因子SMAD3的出核，轉(zhuǎn)錄因子Sox家族成員依賴高遷移框結(jié)構(gòu)(High-mobility group, HMG)被XPO4識別互作并介導(dǎo)入核(Lipowskyetal., 2000; Kurisakietal., 2006; Zhangetal., 2014)，xpo4敲除時致使胚胎干細胞中轉(zhuǎn)錄因子Sox表達降低，向內(nèi)胚層分化，同時抑制神經(jīng)外胚層的分化(Sangeletal., 2014)。XPO5能轉(zhuǎn)運細胞核內(nèi)的pre-miRNA至細胞質(zhì)，翻譯延長因子eEF1A能通過氨酰tRNA間接結(jié)合至XPO5出核。XPO5能介導(dǎo)tRNA及腺病毒RNA的出核，并被證實與RNA結(jié)合蛋白STAU2、白介素增強子結(jié)合因子ILF3的出核相關(guān)(Bohnsacketal., 2002; Gwizdeketal., 2003; Gwizdeketal., 2004; Macchietal., 2004)。XPO6在前纖維蛋白(Profilin)的協(xié)助下，將細胞核內(nèi)的肌動蛋白轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)中，XPO6是Profilin-Actin復(fù)合物的唯一的出核載體，xpo6基因缺陷的果蠅突變體是隱性致死的(Perrimonetal., 1989; Stuvenetal., 2003; Fioreetal., 2017)。XPO7(RanBP16)也是一種具有雙向轉(zhuǎn)運功能的Kap之一，XPO7對血細胞的紅系分化及去核是必要的(Hattangadietal., 2014; Aksuetal., 2018)。免疫分析及亞細胞定位分析表明XPO7多為信號通路中的負調(diào)控因子，能與Smyd3、Sufu、MetAP1和Sestrin2等貨物蛋白相互作用并轉(zhuǎn)運出核(Aksuetal., 2018)。質(zhì)譜分析表明XPO7能介導(dǎo)eIF1、eIF4AI、p50RhoGAP、14-3-3σ以及逆轉(zhuǎn)運復(fù)合物(Retromer)中Vps35、Vps26和Vps29亞基的出核轉(zhuǎn)運。不同于CRM1識別的NES，eIF1及p50RhoGAP等貨物蛋白以富含正電荷氨基酸殘基信號被XPO7識別，而且親和力較低(Haftetal., 2000; Mingotetal., 2004)。XPOt依賴于與RanGTP的結(jié)合，雙向穿梭于NPC，主要與tRNA形成復(fù)合體出核。XPOt識別成熟的、正確折疊的tRNA，與tRNA的二氫尿嘧啶環(huán)(DHU loop)、氨基酸臂和TψC環(huán)等多個位點密切結(jié)合，tRNA的三級結(jié)構(gòu)破壞后出核轉(zhuǎn)運受阻礙(Artsetal., 1998; Kuerstenetal., 2002; Cooketal., 2009)。但是昆蟲中缺乏XPOt的同源物(Lippaietal., 2000)。一些雙向轉(zhuǎn)運蛋白也具有核輸出功能，其中Importin13是典型的雙向轉(zhuǎn)運蛋白，介導(dǎo)Mago-Y14二聚體、糖皮質(zhì)激素受體(Glucocorticoid receptor, GR)、泛素結(jié)合酶9(Ubiquitin conjugating enzyme 9, Ubc9)等蛋白的核輸入，Importin13也是eIF1A、eIF4G2和高遷移率蛋白HMG20A的核輸出受體蛋白(Mingotetal., 2001; Bonoetal., 2010; Fatimaetal., 2017; Baadeetal., 2018)。在果蠅幼蟲中，Importin13與突觸穩(wěn)態(tài)間接相關(guān)，影響神經(jīng)肌肉接點處突觸前膜神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，可能控制視覺光轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)過程(Giagtzoglouetal., 2009)。

4 昆蟲細胞中核輸出現(xiàn)象及其功能

昆蟲的生命活動中，生殖發(fā)育、代謝循環(huán)和免疫反應(yīng)等各種生理活動依賴于不同基因的有序表達及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，這些途徑都需要相應(yīng)的激活因子進行核質(zhì)穿梭或者轉(zhuǎn)錄出的mRNA、miRNA、piRNA等各種RNA的核輸出。高等真核生物細胞分裂時，細胞核與細胞質(zhì)的內(nèi)容物會短暫的混合，回到間期后需要重新分離，如肌動蛋白等需要在完成核膜重構(gòu)后從細胞核內(nèi)分離出去，出核過程需要XPO6的協(xié)助(Stuvenetal., 2003)。昆蟲各項生命活動與核質(zhì)轉(zhuǎn)運具有緊密的聯(lián)系，核質(zhì)轉(zhuǎn)運對于維持和調(diào)控昆蟲生命活動具有不可或缺的作用。轉(zhuǎn)化生長因子β(Transforming growth factor β, TGF-β)是調(diào)節(jié)細胞增殖、分化和凋亡的蛋白(Upadhyayetal., 2017)，如TGF-β信號通路的下游轉(zhuǎn)錄因子Smad與Wnt信號通路中下游核受體β-Catenin需要依賴于RanBP3促進轉(zhuǎn)錄因子的出核調(diào)控信號通路，Smad系列蛋白的核質(zhì)穿梭依賴不同途徑的核輸出受體蛋白的協(xié)助，Smad3的核輸出由XPO4介導(dǎo)(Daietal., 2009)。果蠅缺氧誘導(dǎo)因子α蛋白Sima依賴NLS和NES反復(fù)地快速核質(zhì)穿梭響應(yīng)細胞缺氧狀態(tài)(Romeroetal., 2008)。細胞周期素B(Cyclin B, CycB)在NPC通道中的CRM1/Emb和Nup62復(fù)合物介導(dǎo)下出核，核輸出保證了細胞質(zhì)中CycB-周期蛋白依賴性激酶1(Cyclin-dependent kinases 1, CDK1)的修飾和形成，這對雄性果蠅減數(shù)分裂的啟動具有關(guān)鍵作用(Okazakietal., 2020)。昆蟲卵母細胞的成熟、胚胎發(fā)育、生物鐘和脂肪體功能調(diào)節(jié)中具有重要作用的Dorsal、Mago-nashi、TIMELESS和Hox蛋白等都需要依賴于核質(zhì)穿梭行使調(diào)節(jié)功能，NES或NLS對這些蛋白是必不可少的(Micklemetal., 1997; Xylourgidisetal., 2006; Duffraisseetal., 2020; Caietal., 2021)。

4.1 RNA的核輸出與昆蟲的發(fā)育及抗病

昆蟲發(fā)育中各種信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)及激活反應(yīng)，都需要明確的激活因子進入細胞核，隨后相應(yīng)基因表達的RNA都必需通過核孔上核轉(zhuǎn)運受體的協(xié)助離開細胞核。包括mRNA、piRNA和miRNA等各類RNA的成熟及調(diào)控過程離不開出核轉(zhuǎn)運，不同轉(zhuǎn)錄因子和RNA出核所需的載體不同，主要但不止于CRM1的介導(dǎo)，還包括Cse1、XPO5和XPOt等在內(nèi)多個核輸出受體蛋白。

piRNA(Piwi-interactingRNA)是動物生殖細胞中一類22 nt左右的保守小RNA，在基礎(chǔ)的免疫通路，在動物發(fā)育中起調(diào)控作用，保護細胞基因組抵御轉(zhuǎn)座子帶來的各種危害(Aravinetal., 2007)。piRNA最早是在果蠅中發(fā)現(xiàn)，果蠅卵巢里的piRNA也研究的最為廣泛與深入。在果蠅的卵巢中，大部分的piRNA來源于雙鏈簇，雙鏈簇從兩個基因組鏈產(chǎn)生piRNA。在果蠅卵巢的生殖細胞核中存在多個NXF轉(zhuǎn)運體，其中依賴于NXF3的piRNA前體在NXT1的協(xié)助下，復(fù)合物通過核孔上的CRM1轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中，隨后piRNA簇的轉(zhuǎn)錄本進入類核周體nuage進行下一步加工(ElMaghrabyetal., 2019; Kneussetal., 2019)。

在蠅類和脊椎動物中，XPO5將pre-miRNA以pre-miRNA-XPO5-RanGTP復(fù)合物的形式輸出到細胞質(zhì)中并釋放，pre-miRNA由Dicer進一步裂解，除此之外，XPO5還能維持pre-miRNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，XPO5過表達時能增強miRNA和Short hairpin RNA(shRNA)介導(dǎo)的RNA干擾(RNA interference, RNAi)(Zeng and Cullen, 2004; Yietal., 2005; Shcherbata, 2019)。CRM1可以介導(dǎo)成熟的miRNA進行核質(zhì)穿梭，LMB的處理或crm1的敲除導(dǎo)致pri-miRNA在細胞核內(nèi)積累，pri-miRNA至pre-miRNA的加工過程中斷(Buessingetal., 2010)。RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex, RISC)中包括Ago1、Ago2及RNA解旋酶(RNA helicase A, RHA)與CRM1有相互作用(Castanottoetal., 2009)，RHA也與NXF1有相互作用(Tang and Wong-Staal, 2000)，表明CRM1可能通過調(diào)節(jié)RISC復(fù)合物的核質(zhì)轉(zhuǎn)運，調(diào)節(jié)miRNA形成過程。

4.2 核輸出與昆蟲免疫反應(yīng)

昆蟲對病原體的細胞固有免疫反應(yīng)的調(diào)控發(fā)生在多個水平上，包括核質(zhì)轉(zhuǎn)運水平，編碼細胞防御蛋白的mRNA的核輸出對于宿主對病原體入侵的反應(yīng)是至關(guān)重要的。在病毒感染期間，特定的病原體相關(guān)分子模式(Pathogen associated molecular patterns, PAMPs)被細胞內(nèi)模式識別受體(Pattern recognition receptors, PRRs)識別。宿主識別病原體啟動自分泌和旁分泌先天免疫信號，產(chǎn)生細胞因子和趨化因子，建立一種促炎、抗增殖的抗病原的狀態(tài)(Kingsolveretal., 2013; Kussetal., 2013)。哺乳動物在面對病毒感染時，以干擾素家族的表達進行免疫反應(yīng)，而昆蟲在病毒感染時，很大程度上依賴RNAi抗病毒。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在果蠅的抗病毒免疫反應(yīng)中，IMD、Toll以及JAK/STAT均在不同程度上發(fā)揮了不同免疫作用(Lemaitre and Hoffmann, 2007; Herrera and Bach, 2019)，而這些免疫途徑涉及的穿梭蛋白需要CRM1等介導(dǎo)核輸出。果蠅的SOCS36E、去泛素化酶dUSP36-B亞型等信號通路的負反饋因子多含有NES能通過exportin途徑出核進行負調(diào)控功能(Thevenonetal., 2009; Thevenonetal., 2020)。

昆蟲的體液免疫主要以合成的凝集素、抗菌肽、酚氧化酶和溶菌酶等與異源病原物進行抗?fàn)?，相?yīng)基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA需要在核輸出受體的協(xié)助下出核才能進一步剪切或翻譯，而有些凝集素需要通過跨核膜運動維持動態(tài)平衡以響應(yīng)免疫反應(yīng)。以昆蟲的體液免疫中凝集素(Lectin)為例，galectin基因在擬南芥Arabidopsisthaliana、果蠅、非洲爪蟾Xenopuslaevis和人類細胞中都存在。Galectin-3(Gal3)是一種多功能蛋白，調(diào)控細胞生長、細胞粘附、細胞間相互作用、細胞凋亡、血管生成和mRNA加工等多種生物學(xué)功能。Gal3在細胞核與細胞質(zhì)間均有存在動態(tài)平衡，磷酸化的Gal3存在于細胞質(zhì)，非磷酸化的Gal3存在于細胞核，Gal3的磷酸化及核輸出過程對Gal3的生物活性是不可或缺的(Takenakaetal., 2004)。Gal3的C端含有NES，通過與CRM1的輔因子Nup98相互作用而不是直接與CRM1結(jié)合完成出核轉(zhuǎn)運，其出核受到LMB的抑制(Haudeketal., 2010)。

4.3 病毒蛋白在昆蟲細胞中的核輸出

4.3.1病毒蛋白的核質(zhì)穿梭

昆蟲等節(jié)肢動物是一個天然的病毒庫，被多種病毒感染，其中一些病毒對昆蟲是致病性的，還有一些病毒是以昆蟲為媒介傳播給脊椎動物和植物。病毒自身并沒有完整的細胞器結(jié)構(gòu)，在進行增殖時需要利用宿主的細胞器合成所需的蛋白質(zhì)和核酸。病毒在進化中產(chǎn)生一些短線性基序(Short linear motifs, SLiM)如NLS與NES，這些SLiM介導(dǎo)病毒蛋白與宿主核質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白相互作用，擾亂爭奪宿主細胞核質(zhì)轉(zhuǎn)運通路(Daveyetal., 2011; Viaetal., 2015)。如甲型流感病毒(InfluenzaAvirus, IAV)的NP蛋白、人巨細胞病毒(Humancytomegalovirus, HCMV)的UL94蛋白和狂犬病毒(Rabiesvirus, RV)P蛋白等同時具有NLS與NES，在感染期間具有雙向核質(zhì)穿梭功能(Liuetal., 2012; Oksayanetal., 2012; Lietal., 2015)。這種穿梭現(xiàn)象對昆蟲病毒復(fù)制周期來說也是必不可少的。雙生病毒的C4蛋白、番茄黃化曲葉病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus, TYLCV)的CP蛋白是典型的穿梭蛋白，對于病毒在植物和昆蟲細胞核內(nèi)的積累是不可缺少的(Kuniketal., 1998; Meietal., 2018)。昆蟲桿狀病毒DNA聚合酶、LEF11等蛋白具有NLS，介導(dǎo)與宿主草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda的Importin α相互作用，轉(zhuǎn)運入核，對病毒的增殖復(fù)制至關(guān)重要(Chenetal., 2017; Chenetal., 2021)。ME53和Ac34等不具有常規(guī)型NLS，但通過特殊的序列能能轉(zhuǎn)運入核，對病毒的增殖復(fù)制也是至關(guān)重要的(Liuetal., 2016b; Qiuetal., 2017)。BmNPV的BRO蛋白具有經(jīng)典的NES，利用家蠶的CRM1進行出核轉(zhuǎn)運(Kangetal., 2006)。AcMNPV中有98個ORF含有符合預(yù)測通式的假定NES(Muetal., 2016)。

4.3.2病毒對宿主核輸出的干擾

除痘病毒和藻病毒外，絕大多數(shù)DNA病毒選擇在宿主的細胞核內(nèi)進行復(fù)制，少量RNA病毒如慢病毒也具有跨越核膜的能力，在細胞核內(nèi)復(fù)制增殖(Kussetal., 2013)。病毒無論是在宿主細胞質(zhì)中復(fù)制還是在細胞核中復(fù)制，多會抑制宿主細胞mRNA的核輸出以逃離宿主的免疫反應(yīng)或爭奪及破壞宿主的核質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)幫助病毒mRNA出核(Kussetal., 2013; Yarbroughetal., 2014)。BmNPV通過編碼miRNA(bmnpv-miR-1)擾亂宿主依賴于RanGTP的XPO5介導(dǎo)的宿主miRNA合成途徑，以此對抗家蠶的RNAi抗病毒反應(yīng)(Singhetal., 2012)。AcMNPV在Sf9細胞核內(nèi)復(fù)制組裝核衣殼時，通過Ac34蛋白抑制宿主CRM1，阻礙肌動蛋白相關(guān)蛋白2/3(Actin-related protein 2/3, Arp2/3)通過CRM1途徑出核，使Arp2/3滯留細胞核內(nèi)協(xié)助病毒復(fù)制(Muetal., 2016)。干擾素(Interferon, IFN)通路也是病毒對宿主免疫反應(yīng)的攻擊位點，而不同病毒應(yīng)對免疫反應(yīng)的機制稍有不同，蟲媒病毒中發(fā)現(xiàn)了多種干擾素拮抗蛋白，如黃病毒科中的非結(jié)構(gòu)蛋白NS5抵抗宿主的抗病毒免疫反應(yīng)，西尼羅病毒(WestNilevirus, WNV)NS5上NES的突變破壞病毒的復(fù)制(Lopez-Denmanetal., 2018)?；卓涎挪《?Chikungunyavirus, CHIKV)是一種經(jīng)伊蚊傳播的病毒，CHIKV通過nsP2蛋白促進宿主STAT1的核輸出而抑制ISG的轉(zhuǎn)錄，從而擾亂宿主干擾素應(yīng)答反應(yīng)(Goertzetal., 2018)。但是這些蟲媒病毒是否以同樣的途徑抑制介體昆蟲的免疫反應(yīng)還有待研究。

5 總結(jié)

核質(zhì)轉(zhuǎn)運是細胞生命活動中最頻繁且重要的過程之一，細胞內(nèi)遺傳信息在不同時空上的選擇性表達是真核生物的根本，核質(zhì)轉(zhuǎn)運過程幾乎深入影響各種細胞活動。本文以果蠅等模式生物為例，簡述核孔結(jié)構(gòu)及核輸出受體基礎(chǔ)研究進展，介紹了核輸出機制在一些昆蟲的發(fā)育與免疫中發(fā)揮的作用?？偟膩碚f，昆蟲細胞內(nèi)幾乎任何的代謝響應(yīng)離不開核質(zhì)轉(zhuǎn)運基礎(chǔ)，核質(zhì)轉(zhuǎn)運通路不僅是各類RNA與蛋白質(zhì)穿梭的通道，實質(zhì)也是基因時序表達的中途限速閥門，通過穿梭蛋白的入核/出核平衡進行激活/關(guān)閉相應(yīng)基因的表達。

昆蟲是天然的病毒庫，如桿狀病毒對昆蟲是致病性的，而寨卡病毒Zikavirus、登革病毒Denguevirus等黃病毒科多個成員以蚊媒為主要載體進行傳播，以及很多植物病毒多以煙粉虱Bemisiatabaci、飛虱和葉蟬等半翅目刺吸式口器昆蟲為介體傳播，這些病毒給醫(yī)學(xué)衛(wèi)生與作物病蟲害管理方面帶來巨大的威脅與挑戰(zhàn)。病毒對宿主核輸出機制的征用與病毒在介體/宿主細胞內(nèi)的增殖復(fù)制密切相關(guān)，是病毒在介體/宿主體內(nèi)傳播的重要手段，以此方向可以作為開發(fā)新的抗病毒藥物的重要靶點。以核輸入受體為靶點的Imp α/β抑制劑伊維菌素(IVM)是目前使用最為廣泛的抗寄生蟲藥物，IVM能顯著抑制登革病毒在白紋伊蚊Aedesalbopictus體內(nèi)的復(fù)制，控制登革病毒的傳播。盡管CRM1的抑制劑LMB對人有很高的毒性，但也是研究核質(zhì)穿梭中最重要的工具。核輸出抑制劑Verdinexor(KPT-335)具有潛在的抗病毒作用，Selinexor(KPT-330)、Eltancxor(KPT-8602)和BIIB-100(KPT-185)等結(jié)構(gòu)極其相似的藥物相繼進入抗腫瘤和抗病毒臨床開發(fā)階段。研究核輸出機制使我們更加充分理解各種細胞活動過程中基因表達調(diào)控的邏輯，也包括病毒與宿主博弈過程中對宿主免疫途徑的操控，這些對控制蚊媒病毒感染及桿狀病毒殺蟲活力的提高提供新的研究思路。