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        circPDSS1通過靶向miR-1298調(diào)控肝癌細胞侵襲、遷移和凋亡的分子機制

        2021-10-19 02:51:52李敏吳興桂朱軍華
        肝臟 2021年9期
        關(guān)鍵詞:肝癌檢測

        李敏 吳興桂 朱軍華

        肝癌全球最常見的人類惡性腫瘤之一,是癌癥相關(guān)死亡的第三大原因[1]。盡管肝切除術(shù)、消融術(shù)和化療等肝癌治療策略不斷完善,但由于其無限增殖、高度浸潤和遠處轉(zhuǎn)移特性,多數(shù)患者預(yù)后仍不理想[2]。因此,深入研究肝癌進展的分子機制對尋找新的策略至關(guān)重要。近年來,環(huán)狀RNA(circRNA)在癌癥進展中的復(fù)雜而關(guān)鍵的作用引起研究者的廣泛關(guān)注[3-4]。circRNA異戊二烯基二磷酸合酶亞基1(circPDSS1)是一種胃癌致癌性RNA,其高表達促進胃癌細胞周期進展并抑制細胞凋亡[5]。序列分析顯示,miR-1298是circPDSS1的潛在靶基因。miR-1298在多種惡性腫瘤中被廣泛下調(diào),從而促進細胞增殖,侵襲性和遷移[6-7]。然而,circPDSS1、miR-1298在肝癌中的作用、二者是否存在調(diào)控作用并不清楚。

        材料與方法

        一、一般資料

        選取2017年1月至2018年12月于進行手術(shù)切除的41對肝癌組織和其對應(yīng)的癌旁組織(正常組織)。所有組織均經(jīng)醫(yī)院病理科確診。所有患者術(shù)前未接受任何放療、化療或免疫治療。每位患者簽署知情同意書,本研究得到醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。

        二、細胞和試劑

        肝癌細胞MHCC97H購于中國科學(xué)院上海細胞庫;TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄酶、SYBRTMGreen Master Mix、miRNeasy Mini試劑盒、miScript II反轉(zhuǎn)錄試劑盒、miScriptSYBR○RGreen PCR試劑盒購自北京天根生化科技有限公司;DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、青鏈霉素雙抗、膜聯(lián)蛋白-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)購自北京索萊寶生物公司;小干擾RNA(si-RNA)、miRNA模擬物(miRNA mimics)、miRNA抑制物(anti-miRNA)、過表達質(zhì)粒(pcDNA-RNA)、雙熒光素酶報告基因載體由北京華大基因公司提供;Transwell小室和基質(zhì)膠購自美國康寧公司;基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9、B細胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl相關(guān)X蛋白(Bax)、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)、兔多克隆抗體、抗抗兔IgG二抗購自上海賽信通公司。

        三、細胞培養(yǎng)和實驗分組

        MHCC97H培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)液中,在37℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2天傳代一次,取對數(shù)期細胞進行實驗。按照每孔2×105個細胞接種6孔板,利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將si-NC、si-circPDSS1、miR-NC、miR-1298 mimics、si-circPDSS1+anti-miR-NC、si-circPDSS1+anti-miR-1298分別轉(zhuǎn)染MHCC97H細胞,依次記為si-NC組、si-circPDSS1組、miR-NC組、miR-1298 mimics組、si-circPDSS1+anti-miR-NC組、si-circPDSS1+anti-miR-1298組,48 h后,參照RT-qPCR步驟檢測轉(zhuǎn)染效果合格后進行后續(xù)分析。

        四、實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測circPDSS1和miR-1298表達

        為檢測circPDSS1表達,TRIzol試劑提取組織標(biāo)本總RNA,核糖核酸酶R孵育15 min除去線性RNA,反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA后,用SYBR○RGreen Master Mix和特異性引物進行RT-qPCR反應(yīng)。circPDSS1上游引物5′-GTGGTGCATGAGA-TCGCCT-3′:下游引物5′-GGGTTGTGTGATG-AAACCTG-3′;內(nèi)參GAPDH上游引物5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTCGAPD-3′,下游引物5′-GAAGATGGTGATGGGATTT-3′。為檢測miR-1298表達,miRNeasy Mini試劑盒提取組織標(biāo)本miRNA,miScript II反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄,miScriptSYBR○RGreen PCR試劑盒進行RT-qPCR反應(yīng)。2-△△Ct法計算circPDSS1和miR-1298表達表達水平。miR-1298上游引物5′-ACACTCCAGCTGG-GTTCATTCGGCTGTCCA-3′:下游引物5′-TGGT-GTCGTGGAGTCG-3′;內(nèi)參U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′:下游引物5′-GTGC-AGGGTCCGAGGT-3′。

        五、細胞凋亡以及遷移侵襲檢測

        (一)細胞凋亡檢測 采用流式細胞術(shù)法。收集各組細胞,重懸于500 μL 1×結(jié)合緩沖液中。按照凋亡檢測試劑盒依次加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI,避光染色30 min。1 h內(nèi)應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

        (二)細胞侵襲檢測 采用Transwell法。用不含血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel基質(zhì)膠,預(yù)先包被Transwell上腔室膜。每組取200 μL細胞懸液(不含血清培養(yǎng)基稀釋,細胞數(shù)為1×105)接種到Transwell上室。取500 μL完全培養(yǎng)基加入到24孔板下室。培養(yǎng)24 h后,用棉簽輕輕拭去上腔室中未過膜細胞。用甲醇固定穿過小室膜孔附著于小室下表面的細胞30 min,結(jié)晶紫染色20 min。倒置顯微鏡下隨機選擇3個視野計數(shù)、拍照,取均值表示細胞侵襲數(shù)量。

        (三)細胞遷移檢 遷移實驗與侵襲實驗類似,不同之處在于Transwell上腔室未包被Matrigel基質(zhì)膠。

        六、蛋白質(zhì)印記(western blot)檢測MMP-2、MMP-9、Bcl-2和Bax蛋白表達

        預(yù)冷的細胞裂解液提取細胞總蛋白,二喹啉甲酸法進行蛋白定量。將蛋白樣品按照每泳道30 μg通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜。在室溫下,將膜在5%脫脂牛奶中封閉1 h。洗膜后,將膜與1∶1000稀釋的一抗4℃孵育過夜。洗膜后,將膜與1∶2000二抗室溫孵育1 h。增強型化學(xué)發(fā)光底物顯色。ImageJ軟件檢測各條帶光密度值計算目的蛋白表達水平。

        七、雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/h3>

        將含有miR-1298結(jié)合位點的circPDSS1野生型(WT)或突變型(MUT)序列片段克隆到psiCHECK-2載體,構(gòu)建雙熒光素酶報告基因載體WT-circPDSS1、MUT-circPDSS1。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將WT-circPDSS1、MUT-circPDSS1分別與miR-1298 mimics、miR-NC共轉(zhuǎn)染,48 h后,使用雙重?zé)晒馑孛笀蟾婊驕y定系統(tǒng)檢測細胞裂解物中的熒光素酶活性。

        八、統(tǒng)計學(xué)分析

        結(jié) 果

        一、circPDSS1和miR-1298在肝癌組織中的表達

        肝癌組織中circPDSS1表達量為3.41±0.33,與肝癌組織的1.00±0.06比較顯著升高(P<0.05);肝癌組織中miR-1298表達量為0.42±0.04,與肝癌組織的1.00±0.07比較顯著降低(P<0.05)。

        二、抑制circPDSS1表達對肝癌MHCC97H細胞侵襲、遷移和凋亡的影響

        與si-NC組比較,si-circPDSS1組MHCC97H細胞circPDSS1的表達顯著降低,侵襲和遷移細胞數(shù)、MMP-2蛋白、MMP-9蛋白和Bcl-2蛋白表達顯著降低,細胞凋亡率、Bax蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見表1和圖1。

        圖1 抑制circPDSS1表達對肝癌MHCC97H細胞侵襲、遷移和凋亡的影響

        表1 抑制circPDSS1表達對肝癌MHCC97H細胞侵襲、遷移和凋亡的影響(±s,n=9)

        三、miR-1298過表達對肝癌MHCC97H細胞侵襲、遷移和凋亡的影響

        與miR-NC組比較,miR-1298組MHCC97H細胞miR-1298表達顯著升高,侵襲和遷移細胞數(shù)、MMP-2蛋白、MMP-9蛋白和Bcl-2蛋白表達顯著降低,細胞凋亡率、Bax蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見表2和圖2。

        圖2 miR-1298過表達對肝癌MHCC97H細胞侵襲、遷移和凋亡的影響

        表2 miR-1298過表達對肝癌MHCC97H細胞侵襲、遷移和凋亡的影響(±s,n=9)

        四、circPDSS1靶向調(diào)控miR-1298的表達

        Circular RNA Interactome預(yù)測顯示,miR-1298與circPDSS1序列間存在結(jié)合位點,見圖3。與miR-NC和WT-circPDSS1共轉(zhuǎn)染組比較,miR-1298 mimics和WT-circPDSS1共轉(zhuǎn)染組MHCC97H細胞的雙熒光素酶活性顯著降低(0.38±0.03 vs 0.97±0.07,P<0.05);與miR-NC和MUT-circPDSS1共轉(zhuǎn)染組比較,miR-1298 mimics和MUT-circPDSS1共轉(zhuǎn)染組MHCC97H細胞的雙熒光素酶活性無顯著變化(1.00±0.05 vs 0.98±0.05,P=0.409)。pcDNA-circPDSS1組MHCC97H細胞miR-1298表達較pcDNA組顯著降低(0.58±0.04 vs 1.00±0.05,P<0.05);si-circPDSS1組MHCC97H細胞miR-1298表達較si-NC組顯著升高(2.77±0.24 vs 1.02±0.05,P<0.05),見表5。提示,circPDSS1靶向負性調(diào)控miR-1298的表達。

        圖3 circPDSS1的序列中含有與miR-1298互補的核苷酸序列

        五、干擾miR-1298表達逆轉(zhuǎn)了抑制circPDSS1表達對肝癌MHCC97H細胞侵襲、遷移和凋亡的作用

        與si-circPDSS1+anti-miR-NC組比較,si-circPDSS1+anti-miR-1298組MHCC97H細胞miR-1298表達顯著降低,侵襲和遷移細胞數(shù)、MMP-2蛋白、MMP-9蛋白和Bcl-2蛋白表達顯著升高,細胞凋亡率、Bax蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見表3和圖4。

        圖4 干擾miR-1298表達逆轉(zhuǎn)了抑制circPDSS1表達對肝癌MHCC97H細胞侵襲、遷移和凋亡的作用

        表3 干擾miR-1298表達逆轉(zhuǎn)了抑制circPDSS1表達對肝癌MHCC97H細胞侵襲、遷移和凋亡的作用(±s,n=9)

        討 論

        circPDSS1是已被鑒定為胃癌、膀胱癌的致癌基因,膀胱癌中circPDSS1表達增加,circPDSS1高表達導(dǎo)致膀胱癌細胞的增殖,侵襲和遷移速率增加[5-8]。本研究探討circPDSS1在肝癌中作用發(fā)現(xiàn),肝癌組織中circPDSS1表達較癌旁正常組織顯著增加,說明circPDSS1高表達可能與肝癌進展有關(guān)。體外功能驗證發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染si-circPDSS1抑制circPDSS1表達可降低肝癌細胞MHCC97H的遷移和侵襲能力。細胞遷移和侵襲是一個復(fù)雜的過程,涉及細胞外基質(zhì)(ECM)降解。眾所周知,MMPs可以降解ECM和基底膜,從而促進癌細胞的遷移和侵襲,且高水平的MMPs與癌細胞轉(zhuǎn)移有關(guān)[9-10]。本研究顯示,抑制circPDSS1可顯著降低MMP2和MMP9表達水平,與功能實驗結(jié)果吻合。此外,抑制circPDSS1還可降低抗凋亡蛋白Bcl-2表達,升高促凋亡蛋白Bax表達,提高細胞凋亡率。以上研究說明,circPDSS1在肝癌中具有癌基因作用。

        研究表明circRNA通過與miRNA相互作用進而調(diào)控靶mRNA表達是其發(fā)揮作用的重要機制。hsa_circ_0001445通過抑制miR-17-3p和miR-181b-5p活性,促進金屬蛋白酶抑制劑3(TIMP3)的表達,抑制肝癌細胞的增殖和遷移[11]。為探討circPDSS1作用機制,本研究通過序列分析發(fā)現(xiàn)miR-1298是circPDSS1的潛在靶基因。既往研究顯示,miR-1298在體內(nèi)、外均能夠抑制鼠類肉瘤病毒癌基因(KRAS)突變驅(qū)動的肺癌細胞生長,抑制膀胱癌細胞增殖,遷移和侵襲能力[12-13]。本研究顯示肝癌組織中miR-1298表達降低,轉(zhuǎn)染miR-1298 mimics可上調(diào)miR-1298表達可降低MHCC97H的遷移和侵襲能力,提高細胞凋亡率,并相應(yīng)改變MMP2、MMP9、Bcl-2和Bax表達水平。進一步研究顯示,miR-1298 mimics還可降低WT-circPDSS1的熒光素酶活性,而MUT-circPDSS1熒光素酶活性無顯著變化,且過表達或抑制circPDSS1可分別降低或升高miR-1298的表達水平,提示circPDSS1對miR-1298具有靶向負調(diào)控作用。此外,干擾miR-1298表達還可逆轉(zhuǎn)抑制circPDSS1對MHCC97H細胞遷移、遷移和凋亡的影響,這進一步說明circPDSS1通過靶向miR-1298參與調(diào)控肝癌細胞的遷移、侵襲和凋亡。

        綜上所述,本研究證實肝癌組織中circPDSS1表達增加,抑制circPDSS1通過上調(diào)miR-1298表達能夠降低肝癌細胞的遷移和侵襲能力,誘導(dǎo)細胞凋亡,表明circPDSS1在肝癌中具有致癌作用,為臨床肝癌治療提供了潛在靶點。

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