李瑞明 楊燕 曾憲煌 孟忠吉

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞肝癌的重要原因之一[1-2]。核苷(酸)類似物[nucleos(t)ide analogues, NAs]廣泛應(yīng)用于乙型肝炎的治療，大多數(shù)患者需要長期治療甚至終身治療，但是隨著治療時(shí)間的延長，產(chǎn)生HBV耐藥性突變的風(fēng)險(xiǎn)會隨之增加[3-5]。本研究旨在建立HBV臨床分離株的體外復(fù)制穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)，研究其特征及其耐藥機(jī)制，并針對不同患者體外篩選有效的抗HBV藥物。

材料與方法

一、 實(shí)驗(yàn)材料

乙肝病毒全長基因組PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由本研究所從乙型肝炎患者血清中克隆擴(kuò)增獲得，在之前的文章中已經(jīng)報(bào)道[6]，參照Gunther等[7]設(shè)計(jì)引物及Durantel等[8]的HBV全長PCR參數(shù)，擴(kuò)增出HBV全長基因組DNA。

質(zhì)粒pcDNA3.0(-)-EGFP-ΔCMV由本研究所構(gòu)建并保存，通過反向PCR刪除了CMV啟動(dòng)子，并在轉(zhuǎn)錄終止序列BGH-pA的下游插入完整的綠色熒光蛋白(EGFP)表達(dá)框(圖1)；大腸桿菌DH5a感受態(tài)購自北京天根生化科技有限公司。

PCR擴(kuò)增儀(美國Bio-Rad)，酶標(biāo)儀(德國Eppendorf)，定量PCR儀(美國ABI stepone plus)，Chamber Slides(美國Thermo Fisher Scientific)；限制性內(nèi)切酶T4 DNA連接酶購自New England Biolabs公司；高保真DNA聚合酶、DIG DNA Labeling and Detection Kit購自羅氏公司；DMEM培養(yǎng)基、脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、胎牛血清、G418(50 mg/mL)購自Invitrogen公司； DNA提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、定量PCR試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；HBsAg和HBeAg EILISA檢測試劑盒購自科美公司；HBcAg和HBsAg抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

人肝癌細(xì)胞系HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞系均為本室保存。

二、研究方法

(一) 引物設(shè)計(jì) 使用Vector Nti設(shè)計(jì)所需要引物，并由擎科生物公司合成。擴(kuò)增0.2拷貝HBV 引物序列：pcDNA-232-HBV-2795-NotI-U tacggg-ccagatatacgcggccgcggatcctgcgcgggacgt，pcDNA-1255-HBV-169-SacI-D aagccatagagcccaccgagctcagatctcgaa-tagaaggaaaaaagtc。擴(kuò)增1.0拷貝HBV引物序列：HBV-X15-BamHI-U cgcggatcctgcgcgggacgtcctttgtc-ta，HBV-X15-BamHI-D cgcggatccagttggcagcacaccc-tagcagc。

(二) 0.2拷貝及1.0拷貝HBV基因組的擴(kuò)增 取2 μg HBV全長基因組PCR產(chǎn)物經(jīng)SapI 37℃酶切4 h，純化后取100 ng回收產(chǎn)物T4 DNA連接酶16℃過夜連接得到環(huán)狀HBV全長基因組。取0.5 μL環(huán)狀HBV全長基因組(稀釋為200 pg/μL)為模板， 引物(10 μmol/L)各1.5 μL，參照Roche高保真試劑盒說明配制反應(yīng)體系，PCR擴(kuò)增HBV全長基因組DNA及0.2拷貝基因組，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產(chǎn)物。

(三) HBV復(fù)制型質(zhì)粒p1.2×HBV-EGFP的構(gòu)建 0.2拷貝HBV基因組PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后與骨架質(zhì)粒pcDNA3.0 (-)-EGFP-ΔCMV各2 μg分別用限制性內(nèi)切酶NotI-HF/SacI-HF 37℃酶切4 h，回收酶切產(chǎn)物及載體，T4 DNA連接酶16℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)菌，在Amp抗性平板上篩選陽性克隆。挑取陽性克隆行菌落PCR，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產(chǎn)物，選取陽性菌落培養(yǎng)過夜抽提質(zhì)粒測序。將上述構(gòu)建的0.2拷貝質(zhì)粒2 μg用限制性內(nèi)切酶BamHI 37℃酶切4 h，回收載體，加入小牛腸堿性磷酸酶(CIP) 0.4 μL，37℃反應(yīng)1 h充分去磷酸化，過柱純化；同時(shí)將1.0拷貝HBV基因組擴(kuò)增產(chǎn)物2 μg用限制性內(nèi)切酶BamHI 37℃酶切4 h并過柱純化；將載體與插入片段用T4 DNA連接酶16℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)菌，在Amp抗性平板上篩選。挑取陽性克隆做菌落PCR，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產(chǎn)物，選取陽性菌落培養(yǎng)過夜抽提質(zhì)粒，送上海生工測序。

(四) 細(xì)胞培養(yǎng)、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及G418篩選 HepG2細(xì)胞用含10%胎牛血清(FBS)、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染參照LipofectamineTM說明書進(jìn)行。在24孔板中按1.0×105/孔接種HepG2細(xì)胞，培養(yǎng)24 h，每孔轉(zhuǎn)入0.5 μg p1.2×HBV-EGFP質(zhì)粒，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，傳代至T25培養(yǎng)瓶加入含700 μg/mL G418篩選培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2～3周，挑選陽性克隆，進(jìn)一步傳代培養(yǎng)保種。收集細(xì)胞系培養(yǎng)上清和細(xì)胞，備檢。

(五) HBsAg和HBeAg的酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測 培養(yǎng)上清中的HBsAg和HBeAg水平，采用ELISA試劑盒參照說明書進(jìn)行檢測。

(六) HBV DNA的Realtime PCR檢測 采用天根DP315病毒基因組提取試劑盒抽提細(xì)胞培養(yǎng)上清總DNA，Realtime PCR檢測HBV DNA水平，引物序列：PGP_v1 cacctctgcctaatcatctc和BC1_v2 ttatacgggtcaatgtccat，擴(kuò)增參數(shù)：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性15 s，60℃退火延伸20 s，循環(huán)40次。

(七) 核衣殼相關(guān)HBV復(fù)制中間體的提取和Southern雜交 核衣殼相關(guān)HBV復(fù)制中間體的提取見參考文獻(xiàn)[6]。核衣殼相關(guān)HBV復(fù)制中間體以1.0%的瓊脂糖凝膠分離，然后于轉(zhuǎn)移緩沖液(0.5 mol/L NaOH,1.5 mol/L NaCl)中轉(zhuǎn)印到Gene Screen Plus尼龍膜上，與DIG標(biāo)記的HBV全長探針雜交，采用成像系統(tǒng)分析雜交信號。

(八) HBsAg和HBcAg的免疫熒光檢測 在8孔chamber slide中每孔接種10 000個(gè)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)24 h后按標(biāo)準(zhǔn)免疫熒光程序檢測HBcAg、HBsAg，共聚焦顯微鏡采集圖像。

結(jié) 果

一、成功構(gòu)建HBV-C基因型臨床分離株1.2×HBV復(fù)制型質(zhì)粒p1.2×HBV-EGFP p1.2×HBV-EGFP包含的HBV來源于臨床分離株(GeneBank序列號為：KM213037.1)[6]。構(gòu)建的p1.2×HBV-EGFP質(zhì)粒經(jīng)測序驗(yàn)證序列無突變，其中HBV序列(nt1402-nt3215-nt1989)包含C基因啟動(dòng)子和增強(qiáng)子II，可以啟動(dòng)包括pgRNA在內(nèi)的HBV mRNA轉(zhuǎn)錄。另外，該1.2×HBV復(fù)制型質(zhì)粒在HBV表達(dá)框下又有EGFP表達(dá)框，可以表達(dá)EGFP(圖1)。

(A)1.2×HBV 基因結(jié)構(gòu)及mRNA示意圖；(B)p1.2×HBV-EGFP質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖

二、成功建立C基因型臨床分離株HBV復(fù)制細(xì)胞系HepG2X15

G418篩選3周后得到一個(gè)穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的陽性克隆，繼續(xù)篩選傳代至第10代，在熒光顯微鏡下可以觀察到幾乎所有的細(xì)胞都呈綠色(圖2)，得到一株HBV-C基因型復(fù)制細(xì)胞系，命名為HepG2X15細(xì)胞系，凍存保種。

圖2 HepG2X15細(xì)胞的綠色熒光蛋白的表達(dá)(40×)

三、HepG2X15細(xì)胞表達(dá)高水平HBsAg和HBcAg

免疫熒光結(jié)果顯示，所有EGFP陽性細(xì)胞都能檢測到高水平HBsAg和HBcAg，而且HBsAg和HBcAg在胞漿和胞核均可見，但是以胞核表達(dá)為主(圖3)。

圖3 HepG2X15細(xì)胞內(nèi)HBsAg和HBcAg的表達(dá)

四、HepG2X15細(xì)胞上清中HBsAg和HBeAg的表達(dá)

在HepG2X15細(xì)胞上清中，ELISA檢測到高水平HBsAg和HBeAg，其中HBsAg高于HepG2.2.15細(xì)胞上清，HBeAg略低于HepG2.2.15細(xì)胞上清(表1)。

表1 HepG2X15細(xì)胞上清中HBsAg和HBeAg的表達(dá)

五、HepG2X15細(xì)胞產(chǎn)生高水平子代病毒分泌到細(xì)胞外

Real-time PCR結(jié)果顯示，HepG2X15細(xì)胞上清HBV DNA達(dá)到108拷貝/mL，略高于HepG2.2.15上清中的HBV DNA水平：(8.18±0.21)×108拷貝/mL vs(6.91±0. 71 )×108拷貝/mL，P>0.05。

六、HepG2X15細(xì)胞內(nèi)檢測到病毒復(fù)制中間體

Southern blot檢測核心顆粒相關(guān)HBV DNA，結(jié)果可見到1～4 kb大小的HBV雜交信號，呈現(xiàn)類似HepG2.2.15細(xì)胞核心相關(guān)HBVDNA的Southern 雜交信號，即HBV復(fù)制中間體，包含松弛環(huán)狀DNA(RC)、雙鏈線狀DNA(DL)和單鏈DNA(SS)。HepG2X15細(xì)胞內(nèi)HBV復(fù)制中間體水平略低于HepG2.2.15(圖4)。

圖4 HepG2X15細(xì)胞內(nèi)HBV的復(fù)制中間體

討 論

當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的HBV復(fù)制細(xì)胞系HepG2.2.15[9]和HepAD38[10]細(xì)胞系都是基于血清型ayw, 基因型D(GeneBank序列號 U95551)的病毒株建立的。由于B和C基因型的HBV是中國人群感染的主要基因型，不同亞型的病毒感染預(yù)后也有很大不同[10-14]，因此有必要建立符合中國人群HBV感染現(xiàn)狀的細(xì)胞模型。

在前期研究中，筆者從乙型肝炎患者血清中克隆了5株HBV臨床分離株，其中基因B型3株，基因C型2株，成功將這些病毒株克隆入pHY106復(fù)制型質(zhì)粒，在轉(zhuǎn)染HepG2及Huh7細(xì)胞的上清中檢測到HBsAg、HBeAg及HBV DNA，細(xì)胞內(nèi)檢測到HBV復(fù)制中間體[6]。本研究中筆者從其中一株臨床分離株克隆C基因病毒HBV-X15全長基因組為模板，成功構(gòu)建1.2×HBV復(fù)制型質(zhì)粒p1.2×HBV-EGFP，轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞篩選得到穩(wěn)定復(fù)制HBV的細(xì)胞系HepG2X15。HepG2X15細(xì)胞內(nèi)可檢測到高水平HBsAg、HBcAg和HBV復(fù)制中間體，上清中高水平的HBsAg、HBeAg和子代HBV DNA。與HepG2.2.15細(xì)胞系相比，上清中HBsAg和HBV DNA水平更高。而且HepG2X15細(xì)胞同時(shí)穩(wěn)定表達(dá)EGFP，有利于陽性篩選，并可能用于動(dòng)物模型體內(nèi)的示蹤顯示。

本研究中構(gòu)建的HepG2X15細(xì)胞系可以支持HBV細(xì)胞內(nèi)的生活周期，達(dá)到與HepG2.2.15相當(dāng)水平的HBV復(fù)制和抗原表達(dá)。使用HBV自身的啟動(dòng)子，更接近體外感染過程后的HBV的自然生命周期，適合用于HBV相關(guān)功能基因(組)的研究。C亞型的HBV是中國人群感染的主要基因型之一，這為進(jìn)一步研究C亞型HBV的結(jié)構(gòu)與功能、基因表達(dá)與調(diào)控，以及體外篩選抗HBV藥物等提供了一個(gè)很好的細(xì)胞模型。