楊 偉 賀 超 張?jiān)購(gòu)?qiáng) 吳 輝 滕 林 丁家望

(1. 三峽大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院[宜昌市中心人民醫(yī)院] 心血管內(nèi)科 & 三峽大學(xué) 心血管病研究所， 湖北 宜昌 443003； 2. 湖北省缺血性心血管疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心， 湖北 宜昌 443003)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種常見病和多發(fā)病，是心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)。臨床流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，患有AS的患者最終均會(huì)發(fā)生心腦血管病變，而心腦血管疾病誘發(fā)的死亡約占疾病死亡的第四位[1]。其中AS導(dǎo)致的急性冠脈綜合征為最常見的AS性心臟病[2]。經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)(percutaneous coronary intervention，PCI)是治療急性冠脈綜合征的有效方法。研究發(fā)現(xiàn)，PCI術(shù)前12 h給予大劑量阿托伐他汀可明顯減少圍手術(shù)期心肌梗死等心血管事件[3]。從治療獲益時(shí)間來看，其機(jī)制顯然不可能是通過降低血脂和改善粥樣硬化斑塊獲得。相關(guān)動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀具有抗炎、抗氧化、抗血栓等作用[4,5]。但是短時(shí)大劑量阿托伐他汀對(duì)于粥樣斑塊影響的研究則較少。本研究應(yīng)用AS模式動(dòng)物小鼠，探究短療程大劑量阿托伐他汀對(duì)AS斑塊的影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

70只4周齡雄性載脂蛋白E基因敲除(apolipoprotein E-/-，apoE-/-)小鼠(由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)合格證號(hào):SCXK(京)2016-0006，均無生育史)，體重17～22 g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組(n=5)和造模組(n=65)。

1.1.2 動(dòng)物造模方法和分組

造模組根據(jù)經(jīng)典AS造模方法[6]給予高脂飲食(高脂混合飼料：1.5%膽固醇、10%蛋黃粉、5%豬油加普通飼料)喂養(yǎng)6周，之后剖殺空白組和造模組隨機(jī)小鼠各5只以確認(rèn)AS造模成功。之后將60只造模組小鼠隨機(jī)分為普通飼料喂養(yǎng)組(對(duì)照組)、高脂組(模型組)、阿托伐他汀常規(guī)劑量+高脂組(常規(guī)劑量組)、中劑量+高脂組(中劑量組)，每組各10只；高劑量+高脂組(高劑量組)20只。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)藥物及給藥方法

阿托伐他汀(輝瑞制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20051407 ，規(guī)格：10 mg×7片， 7片/盒)的成人劑量為10 mg/d。根據(jù)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物藥理學(xué)》[7]小鼠(20 g)與人(70 kg)的常規(guī)藥物換算系數(shù)為9.1，則每只小鼠服藥量為2.5 mg/(kg·d)。即常規(guī)劑量組灌胃為2.5 mg/(kg·d)，中劑量組為5.0 mg/(kg·d)，高劑量組為10 mg/(kg·d)。采用0.9%生理鹽水溶解藥物后灌胃，灌胃量為0.1 mL/只，1次/d，連續(xù)灌胃2周。其中高劑量組動(dòng)物再分為負(fù)荷劑量組(10只)和非負(fù)荷劑量組(10只)，負(fù)荷劑量組于干預(yù)結(jié)束前2 h追加阿托伐他汀2.5 mg/kg，非負(fù)荷劑量組不追加。對(duì)照組和模型組分別給予普通飼料和高脂飼料繼續(xù)喂養(yǎng)2周。

1.2 動(dòng)物處理

藥物灌胃2周后，斷頸處死小鼠，眼球取血，采用高速離心機(jī)(Thermo，USA)3 500 r/min離心10 min，取血清-80℃保存、備用。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1 ELISA試劑盒檢測(cè)脂蛋白水平及炎癥因子水平

各組取胸主動(dòng)脈組織約0.5 cm，加0.5 mL生理鹽水勻漿2 min，500 r/min離心5 min，取上清液于-80℃保存。按照ELISA試劑盒說明書的步驟，測(cè)定各組小鼠血清高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)(南京建成生物工程公司，批號(hào)：20201118847)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)(南京建成生物工程公司，批號(hào)：20201118786)、氧化型低密度脂蛋白膽固醇(oxidative low density lipoprotein cholesterol，ox-LDL)(南京建成生物工程公司，批號(hào)：20201118684)水平；各組小鼠血清和斑塊內(nèi)腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF-α)(天根生化科技有限公司，批號(hào)：20201017879)、白介素-6(interleukin 6，IL-6)(天根生化科技有限公司，批號(hào)：20201016679)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)(天根生化科技有限公司，批號(hào)：20201015379)的水平。

1.3.2 血小板計(jì)數(shù)及血小板膜蛋白檢測(cè)

采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)外周血的血小板數(shù)量(platelet，PLT)。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞數(shù)：細(xì)胞數(shù)量=(4個(gè)大格細(xì)胞總數(shù)/4)×稀釋倍數(shù)(10)×106。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)血小板膜蛋白CD62P、CD31的平均熒光強(qiáng)度，采用FlowJo軟件進(jìn)行分析。

1.3.3 胸主動(dòng)脈HE染色

取約0.5 cm胸主動(dòng)脈組織， PBS液沖洗約3 min，4%甲醛固定24～48 h，10%、20%、30%蔗糖梯度脫水各1 d、3 d后石蠟包埋、切片。石蠟切片后常規(guī)HE染色，中性樹脂封片，血管內(nèi)斑塊面積采用自動(dòng)成像分析軟件系統(tǒng)(Olympus)分析，每只動(dòng)物取 5張切片計(jì)算斑塊面積平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布組間比較則采用方差分析，不符合則采用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù) (%)表示，組間差異采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清HDL-C、LDL-C、ox-LDL水平比較

灌胃期間模型組小鼠死亡1只，其余組小鼠無死亡。與模型組比較，對(duì)照組、常規(guī)劑量組、中劑量組、負(fù)荷劑量組和非負(fù)荷劑量組HDL-C均顯著增高(均P<0.05)，LDL-C均顯著降低(均P<0.05)。與模型組比較，負(fù)荷劑量組ox-LDL降低(P<0.05)，具體見表1。

表1 各組血清HDL-C、LDL-C、OX-LDL水平比較

2.2 各組血清及斑塊內(nèi)TNF-α、IL-6、MCP-1水平比較

與模型組比較，對(duì)照組及藥物干預(yù)組血清TNF-α、IL-6、MCP-1均顯著降低(均P<0.05)。負(fù)荷劑量組血清TNF-α、IL-6、MCP-1明顯低于對(duì)照組和其他三組藥物組(均P<0.05)。中劑量組、負(fù)荷劑量組、非負(fù)荷劑量組血清TNF-α、IL-6、MCP-1均低于對(duì)照組(均P<0.05)。各組斑塊內(nèi)TNF-α、IL-6、MCP-1與血清中各炎癥因子的表達(dá)趨勢(shì)一致，具體見表2。

表2 各組血清及斑塊內(nèi)TNF-α、IL-6、MCP-1水平比較

2.3 各組PLT、CD62P、CD31水平比較

與模型組比較，對(duì)照組及藥物干預(yù)組PLT均明顯減少，CD31和CD62P熒光強(qiáng)度均顯著降低(均P<0.05)。與對(duì)照組比較，藥物干預(yù)組CD31熒光強(qiáng)度明顯下降(均P<0.05)，具體見表3。

表3 各組PLT、CD31、CD62P水平比較

2.4 各組主動(dòng)脈內(nèi)斑塊面積比較

與模型組比較，常規(guī)劑量組、中劑量組、負(fù)荷劑量組和非負(fù)荷劑量組斑塊面積顯著減小(均P<0.05)，具體見表4。

表4 各組主動(dòng)脈校正斑塊面積

3 討論

預(yù)防斑塊破裂、出血、擴(kuò)張堵塞血管是治療并改善AS患者預(yù)后的有效途徑。阿托伐他汀屬于他汀類調(diào)脂藥物，是臨床常用的AS基礎(chǔ)性治療藥物[8]。藥理學(xué)認(rèn)為，阿托伐他汀是一種選擇性較強(qiáng)的3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶，通過降低酶活性達(dá)到減少膽固醇合成的目的，在控制血脂的同時(shí)，還能通過降低CD31等血小板聚集性蛋白的表達(dá)發(fā)揮抗血小板聚集的作用[9]。另外，阿托伐他汀也可能通過抑制炎性細(xì)胞在主動(dòng)脈的聚集、浸潤(rùn)，并下調(diào)炎性因子，如血管細(xì)胞黏附分子(vascular cell adhesion molecule -1，VCAM-1)和MCP-1在主動(dòng)脈內(nèi)膜的表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)、拮抗AS的發(fā)生[10]。PCI術(shù)前12 h給予大劑量阿托伐他汀可明顯減少圍手術(shù)期心肌梗死等心血管事件的發(fā)生率[3]。短時(shí)大劑量阿托伐他汀是如何影響動(dòng)脈粥樣斑塊，繼而減少圍手術(shù)期心肌梗死、心力衰竭等心血管疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，目前尚未可知。

本研究以AS模型小鼠為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀能夠通過降低LDL-C、提高HDL-C，抑制TNF-α、IL-6、MCP-1等炎癥因子水平，拮抗血小板聚集，最終縮小斑塊面積達(dá)到治療AS的目的，與之前的研究相一致[11]。雖然常規(guī)劑量組、中劑量組、負(fù)荷劑量組和非負(fù)荷劑量組都能改善上述指標(biāo)，但僅負(fù)荷劑量組可降低ox-LDL。AS時(shí)激活氧化應(yīng)激及血管局部炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生過量的超氧化物、氧自由基，使LDL氧化修飾成ox-LDL[12]。巨噬細(xì)胞吞噬ox-LDL成為泡沫細(xì)胞，是形成AS的重要條件。而通過降低LDL，尤其是ox-LDL水平則可以顯著降低心血管事件的發(fā)生率[13]。

炎癥活化貫穿于AS的整個(gè)病理生理過程, 血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷后，白細(xì)胞粘附到內(nèi)皮，激活免疫細(xì)胞釋放IL、TNF等炎癥介質(zhì)，后者促使巨噬細(xì)胞表達(dá)清道夫受體，大量攝取ox-LDL形成泡沫細(xì)胞，炎癥激活不但加速AS的發(fā)生和發(fā)展，還參與血栓形成，促進(jìn)斑塊破裂[14]。Abela等[15]研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)血清TNF-α和IL-6水平可以顯著降低AS患者心血管意外事件的發(fā)生率。無論如何謹(jǐn)慎的操作，PCI術(shù)對(duì)于動(dòng)脈斑塊的“激惹”均難以避免。與術(shù)前相比，PCI術(shù)后患者體內(nèi)炎癥因子水平顯著增加是導(dǎo)致不良心血管事件發(fā)生的重要因素[16]。而早期大劑量應(yīng)用阿托伐他汀可能通過抑制炎癥反應(yīng)而減少心血管事件的發(fā)生。MCP-1是由血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌的一種趨化因子，具有趨化活性，并可活化單核/巨噬細(xì)胞。炎癥因子是激活上述細(xì)胞分泌MCP-1的主要介質(zhì)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，與斑塊內(nèi)炎癥因子相比，阿托伐他汀降低血清炎癥因子的作用更強(qiáng)，可能與藥物代謝分布有關(guān)。

凝血過度激活也是心血管事件的重要誘因。斑塊破裂，纖維素、細(xì)胞壞死物質(zhì)、泡沫細(xì)胞等內(nèi)容物溢出，激活血小板誘發(fā)彌散性血管內(nèi)凝血，微小血栓隨血流阻塞心腦微小血管是造成心肌梗死、廣泛性腦缺血梗死的主要因素[18]。譚朝陽(yáng)等[19]研究發(fā)現(xiàn)，與低劑量相比，高劑量阿托伐他汀降低血小板聚集率、血小板粘附率的效果更為顯著。Deng等[20]研究則認(rèn)為，大劑量阿托伐他汀不僅能夠降低血小板濃度，抑制血小板激活，同時(shí)也能夠顯著降低血脂水平和炎癥因子濃度。阿托伐他汀抑制血小板激活可能與降低血小板表面粘附性蛋白CD31等表達(dá)有關(guān)。血脂、炎癥因子、血小板等促AS物質(zhì)減少，斑塊面積則顯著縮小[21]。

綜上所述，短程大劑量阿托伐他汀可能通過降低血脂水平，抑制相關(guān)炎癥因子釋放，調(diào)節(jié)血小板數(shù)目及血小板膜蛋白的表達(dá)，進(jìn)而干預(yù)AS斑塊形成。