朱俊喆，鄧曉茜，胡曉淞，李云捷，趙慧君*

（湖北文理學(xué)院 湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北 襄陽(yáng) 441053）

大頭菜（Brassica iuncea）原產(chǎn)于我國(guó)，隸屬于蕓苔屬一年生草本植物，栽培面積約100萬(wàn)hm2，具有極其豐富的莖用、葉用和根用等價(jià)值[1]。腌制大頭菜葉以根用大頭菜的綠葉為主要原料，并輔以食鹽、姜末和大蒜等發(fā)酵制成，經(jīng)過(guò)清洗切斷、曬干脫水、輔料混合和厭氧發(fā)酵等過(guò)程[2-3]。在腌制過(guò)程中，芥菜葉中的硫代葡萄糖苷和氨基酸等，在酸和酶的作用下生成芥子油等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，賦予成品獨(dú)特的香味[4]。研究報(bào)道顯示，大頭菜葉腌制一般為自然發(fā)酵，葉片表面附著的微生物起主要作用，包括乳酸球菌、乳酸桿菌、酵母菌和腸膜明串珠菌等有益微生物[5]。目前，對(duì)于大頭菜葉腌制的研究主要集中在發(fā)酵工藝優(yōu)化[6]、減少食鹽用量[7-8]和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究[9]以及提取物抗氧化上等[10-13]，而對(duì)于腌制大頭菜葉中微生物多樣性的研究卻相對(duì)較少。

隨著測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，Illumina MiSeq 高通量測(cè)序技術(shù)快速發(fā)展，以其快速高效等特點(diǎn)，成為微生物群落多樣性解析的主要工具[14]，目前廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品中微生物多樣性解析[15-18]。周森等[19]利用Illumina MiSeq 高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)來(lái)自5個(gè)地區(qū)的11份清香型大曲中微生物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)清香型大曲中細(xì)菌微生物多樣性豐富，真菌則以扣囊覆膜酵母為優(yōu)勢(shì)真菌；瑪依樂(lè)·艾海提等[20]利用高通量測(cè)序技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)南疆傳統(tǒng)酸奶中厚壁菌門（Firmicutes）和子囊菌門（Ascomycota）分別為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門和真菌門。蔡懷依等[21]利用Illumina MiSeq 高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)新鮮年糕內(nèi)細(xì)菌多樣性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)年糕內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌屬為玫瑰色半光合菌屬（Roseateles）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）。

本研究以湖北省來(lái)鳳縣腌制大頭菜葉樣品為研究對(duì)象，采用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)，以細(xì)菌16S rRNA和真菌18S rRNA為靶點(diǎn)，對(duì)腌制大頭菜葉中細(xì)菌和真菌微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行了解析。本研究通過(guò)對(duì)腌制大頭菜中微生物的研究，以期為后續(xù)腌制大頭菜葉品質(zhì)提升、純種發(fā)酵及安全評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

LB培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司；QIAGEN DNeasy mericon Food Kit 脫氧核糖核苷酸（deoxyribo nucleic acid，DNA）基因組提取試劑盒：德國(guó)QIAGEN公司；脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphates，dNTPs）混合液、FastPfu Fly DNA聚合酶、5×TransStartTMFastPfu Buffer：北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2D型雙人單面凈化工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；ND-2000C微量紫外分光光度計(jì)：美國(guó)Thermo公司；Veriti FAST梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)polymerase chain reaction，PCR）儀：美國(guó)ABI公司；DYY-12電泳儀：北京六一儀器廠；UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)：美國(guó)ProteinSimple公司；Illumina MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)：美國(guó)Illumina公司；R920機(jī)架式服務(wù)器：美國(guó)Dell公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

從恩施土家族苗族自治州來(lái)鳳縣北門菜市場(chǎng)和金鳳市場(chǎng)采集腌制大頭菜葉樣品3份，分別標(biāo)記為L(zhǎng)F1、LF2、LF3，置于含有冰袋的采樣箱中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 樣品微生物宏基因組DNA的提取

稱取2.0 g腌制大頭菜葉樣品，按照QIAGEN DNeasy mericon Food Kit DNA基因組提取試劑盒說(shuō)明書步驟對(duì)樣品DNA進(jìn)行提取。

1.3.3 細(xì)菌16S rRNA的PCR擴(kuò)增

使用加入成對(duì)核苷酸標(biāo)簽（barcode）的引物，參照文獻(xiàn)[22]中的PCR擴(kuò)增體系和條件對(duì)細(xì)菌16S rRNA V3-V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：5×PCR緩沖液4 μL，dNTPs混合液（2.5 mmol/L）2 μL，正反向引物（5 μmol/L）各0.8 μL，DNA聚合酶（5 U/μL）0.4 μL，DNA模板10 ng，補(bǔ)充雙蒸水（ddH2O）至20 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)30 次；72 ℃再延伸10 min。

1.3.4 真菌18S rRNA序列擴(kuò)增

加入成對(duì)核苷酸標(biāo)簽（barcode）的引物，對(duì)真菌18SrRNA V3-V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系及條件同1.3.3。

1.3.5 高通量測(cè)序及生物信息學(xué)分析

將經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)成功的PCR產(chǎn)物，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，使用Illumina MiSeq PE300高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。將返回序列拼接后進(jìn)行質(zhì)控[23]，對(duì)齊和去除引物。參照沈馨等[24]的分析流程，使用QIIME（V1.70）平臺(tái)對(duì)質(zhì)控后合格的序列進(jìn)行物種分析和多樣性評(píng)價(jià)。1）使用PyNAST軟件對(duì)序列進(jìn)行對(duì)齊；2）按照97%和100%相似度對(duì)序列進(jìn)行兩步UCLUST法構(gòu)建操作分類單元（operationaltaxonomicunits，OTU）矩陣；3）使用ChimeraSlayer軟件將含有嵌合體的OTU進(jìn)行篩選與去除；4）挑選OTU代表性序列，使用RDP、SILVA和GREE-NGENE 3 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比對(duì)，明確不同水平的分類學(xué)地位；5）計(jì)算Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和發(fā)現(xiàn)物種數(shù)，進(jìn)而對(duì)微生物群落的多樣性和豐度進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.3.6 多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用柱狀圖表示樣品中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門和真菌門構(gòu)成及相對(duì)含量；使用熱圖對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬和真菌屬間相關(guān)性進(jìn)行可視化處理；使用R軟件（V3.6.2）對(duì)文中的圖進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列豐度和多樣性分析

對(duì)納入本研究的3 份腌制大頭菜葉樣品的16S rRNA和18S rRNA高通量測(cè)序結(jié)果的不同分類學(xué)地位進(jìn)行數(shù)量統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如表1所示。

表1 腌制大頭菜葉樣品測(cè)序結(jié)果及不同分類學(xué)地位數(shù)量統(tǒng)計(jì)Table 1 Sequencing results and quantitative statistics in different taxonomic status of pickled kohlrabi leaves samples

由表1可知，3 個(gè)樣品共產(chǎn)生102 905 條高質(zhì)量16S rRNA序列，平均每個(gè)樣品產(chǎn)生34 301 條；共產(chǎn)生131 955 條高質(zhì)量18S rRNA序列，平均每個(gè)樣品產(chǎn)生43 985 條。按照97%和100%的相似度對(duì)序列進(jìn)行劃分后分別得到8 217個(gè)細(xì)菌OTU和2 340 個(gè)真菌OTU。

當(dāng)細(xì)菌測(cè)序量達(dá)到24 010 時(shí)，樣品BLF1的超1指數(shù)最高為1 754，樣品BLF3的香農(nóng)指數(shù)最高為8.25；當(dāng)真菌測(cè)序量達(dá)到40 010 時(shí)，樣品FLF2的超1指數(shù)最高為3 559，樣品FLF3的香農(nóng)指數(shù)最高為4.38。由此可見(jiàn)，3 號(hào)樣品細(xì)菌和真菌菌落較其他2個(gè)樣品具有較高的物種多樣性。值得一提的是，細(xì)菌菌落香農(nóng)指數(shù)均高于真菌，而超1指數(shù)均低于真菌，說(shuō)明腌制大頭菜葉中細(xì)菌群落多樣性較高且分布均勻，而真菌的群落結(jié)構(gòu)多樣性和分布均勻性均不如細(xì)菌，可能與密封發(fā)酵中的厭氧環(huán)境對(duì)真菌生長(zhǎng)抑制以及腌制大頭菜制作環(huán)境的差異有關(guān)[25]。

2.2 基于不同分類地位的微生物菌群種類及平均相對(duì)含量分析

腌制大頭菜葉樣品中細(xì)菌和真菌優(yōu)勢(shì)門（相對(duì)含量＞1%）種類及平均相對(duì)含量如圖1所示。

圖1 腌制大頭菜葉細(xì)菌（A）和真菌（B）優(yōu)勢(shì)門平均相對(duì)含量分析Fig.1 Average relative contents of bacteria (A) and fungi (B) dominant phylum of pickled kohlrabi leaves

3個(gè)腌制大頭菜葉樣品在門的分類水平上，注釋到明確分類地位的分別有20個(gè)細(xì)菌門和3個(gè)真菌門，其中平均相對(duì)含量＞1%的細(xì)菌門有4個(gè)，分別為硬壁菌門（Firmicutes，52.28%）、變形菌門（Proteobacteria，38.40%）、放線菌門（Actinobacteria，4.30%）和擬桿菌門（Bacteroidetes，2.83%）；平均相對(duì)含量＞1%的真菌門有2個(gè)，分別為子囊菌門（Ascomycota，88.19%）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota，11.15%）。

本研究進(jìn)一步對(duì)腌制大頭菜葉樣品中細(xì)菌和真菌優(yōu)勢(shì)屬（相對(duì)含量＞1%）的種類及平均相對(duì)含量進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如圖2所示。

圖2 腌制大頭菜葉細(xì)菌（A）和真菌（B）優(yōu)勢(shì)屬平均相對(duì)含量分析Fig.2 Average relative contents analysis of bacteria (A) and fungi (B)dominant genera of pickled kohlrabi leaves

在屬的分類水平上，注釋到明確分類地位的細(xì)菌屬和真菌屬分別有382個(gè)和31個(gè)。

由圖2（A）可知，腌制大頭菜葉樣品中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬有12個(gè)，分別為乳酸桿菌屬（Lactobacillus，22.45%）、假單胞菌屬（Pseudomonas，10.97%）、櫻桃樣芽胞桿菌屬（Cerasibacillus，10.58%）、腸桿菌屬（Enterobacter，8.29%）、枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus，6.44%）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter，6.06%）、芽孢桿菌屬（Bacillus，2.50%）、魏斯氏菌屬（Weissella，2.08%）、歐文氏菌屬（Erwinia，1.65%）、氣單胞菌屬（Aeromonas，1.42%）、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas，1.09%）和乳球菌屬（Lactococcus，1.02%）。由圖2（B）可知，腌制大頭菜葉樣品中優(yōu)勢(shì)真菌屬有8 個(gè)，分別為接合酵母屬（Zygosaccharomyces，55.29%）、德巴利氏酵母屬（Debaryomyces，9.33%）、隱球菌屬（Cryptococcus，7.97%）、假絲酵母屬（Candida，6.83%）、枝孢屬（Cladosporium，6.70%）、曲霉菌屬（Aspergillus，4.23%）、畢赤酵母屬（Pichia，1.57%）和節(jié)菌屬（Wallemia，1.07%）。由圖2亦可知，細(xì)菌屬和真菌屬分別有5.04%和5.40%的屬不能注釋到明確的分類地位。

值得一提的是，接合酵母屬（Zygosaccharomyces）在樣品FLF1中含量高達(dá)91.95%，與其他樣品存在較明顯差異，且隱球菌屬（Cryptococcus）在樣品FLF3中相對(duì)含量為22.06%，而在FLF1和FLF2中僅含有0.24%和1.62%，進(jìn)一步證明，不同大頭菜樣品中真菌菌群分布不均勻。

2.3 OTU統(tǒng)計(jì)分析

據(jù)統(tǒng)計(jì)，樣品中細(xì)菌和真菌OTU總數(shù)分別為7 510個(gè)和1 959個(gè)，而3個(gè)樣品共有的OTU分別為143個(gè)和88個(gè)。本研究進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)了樣品中平均相對(duì)含量大于1%的核心OTU構(gòu)成及平均相對(duì)含量，結(jié)果如圖3所示。

圖3 腌制大頭菜葉細(xì)菌（A）和真菌（B）核心OTU平均相對(duì)含量分析Fig.3 Average relative content analysis of bacteria (A) and fungi (B)core OTU of pickled kohlrabi leaves

由圖3（A）可知，3個(gè)樣品中核心細(xì)菌OTU有17個(gè)，其中有5個(gè)隸屬于乳酸桿菌屬（Lactobacillus），4個(gè)隸屬于腸桿菌屬（Enterobacter）、4個(gè)隸屬于假單胞菌屬（Pseudomonas）、1個(gè)隸屬于枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus）、1個(gè)隸屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）、1個(gè)隸屬于魏斯氏菌屬（Weissella）。由圖3（B）可知，3個(gè)樣品中核心真菌OTU有11個(gè)，其中有3個(gè)隸屬于枝孢屬（Cladosporium）、3 個(gè)隸屬于接合酵母屬（Zygosaccharomyces）、2個(gè)隸屬于曲霉菌屬（Aspergillus）、1個(gè)隸屬于德巴利氏酵母屬（Debaryomyces）、1個(gè)隸屬于隱球菌屬（Cryptococcus）和一個(gè)僅鑒定到綱的銀耳綱（Tremellomycetes）。

此外，細(xì)菌OTU867（隸屬于腸桿菌屬）在樣品BLF2含量達(dá)到21.32%，在樣品BLF1和BLF3中含量?jī)H為0.03%和1.30%；真菌OTU1675（隸屬于德巴利氏酵母屬）在樣品FLF1和FLF2中含量高達(dá)92.57%和48.12%，而在樣品FLF3中僅含2.80%。由此可見(jiàn)，雖然細(xì)菌和真菌的核心OTU在所有樣品中均存在，但是在每個(gè)樣品中的含量卻存在明顯的差異[26]，進(jìn)一步證明自然發(fā)酵蔬菜中微生物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性受制作環(huán)境的影響，進(jìn)而影響發(fā)酵蔬菜的品質(zhì)。

2.4 核心細(xì)菌屬和真菌屬相關(guān)性分析

本研究共發(fā)現(xiàn)12個(gè)核心細(xì)菌屬和8個(gè)核心真菌屬，其相關(guān)性熱圖如圖4所示。

圖4 腌制大頭菜葉細(xì)菌和真菌優(yōu)勢(shì)屬相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis of bacteria and fungi dominant genera of pickled rutabaga leaves

由圖4可知，曲霉菌屬（Aspergillus）與假單胞菌屬（Pseudomonas）和枝孢屬（Cladosporium）與魏斯氏菌屬（Weissella）呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），而其他優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬和真菌屬之間相關(guān)性均不顯著（P＞0.05）。由此可見(jiàn)，腌制大頭菜葉中部分真菌和細(xì)菌之間存在著明顯的共生關(guān)系，這種共生關(guān)系對(duì)發(fā)酵蔬菜的品質(zhì)有什么樣的影響還需要進(jìn)一步的研究。

3 結(jié)論

本研究利用Illumina MiSeq第二代測(cè)序技術(shù)對(duì)3 個(gè)腌制大頭菜葉樣品進(jìn)行微生物多樣性研究后發(fā)現(xiàn)，共鑒定出20 個(gè)細(xì)菌門，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門有4個(gè)，分別為硬壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）；鑒定出3個(gè)真菌門，優(yōu)勢(shì)真菌門僅有2 個(gè)，分別為子囊菌門（Ascomycota）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota）。優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬分別為隸屬于硬壁菌門的乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、櫻桃樣芽孢桿菌屬（Cerasibacillus）、枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）和乳球菌屬（Lactococcus）；隸屬于變形菌門的假單胞菌屬（Pseudomonas）、腸桿菌屬（Enterobacter）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、歐文氏菌屬（Erwinia）、氣單胞菌屬（Aeromonas）和鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）。優(yōu)勢(shì)真菌屬分別為隸屬于子囊菌門的接合酵母屬（Zygosaccharomyces）、德巴利氏酵母屬（Debaryomyces）、假絲酵母屬（Candida）、枝孢屬（Cladosporium）、曲霉菌屬（Aspergillus）和畢赤酵母屬（Pichia）；隸屬于擔(dān)子菌門的隱球菌屬（Cryptococcus）和節(jié)菌屬（Wallemia）。結(jié)果表明，由于是自然發(fā)酵，制作環(huán)境的不同造成腌制大頭菜葉樣品中間微生物多樣性差異較高，密閉發(fā)酵的方式造成樣品中細(xì)菌群落物種種類和分布的均勻性高于真菌。